可被激活Cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfDNA的检测

本发明涉及可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，具体为可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测。

背景技术：

1、目前cfdna传感策略的主要挑战是低靶浓度和片段间高序列同源性，用于检测cfdna的方法可以大致分为针对特定变化的方法和允许检测dna中所有可能畸变的方法两大类，而第二种方法要么是基于电泳分析，要么是基于聚合酶链反应分析，如下一代测序(ngs)。ngs提供了一个平台，可以对单个核苷酸的片段大小进行测序和确定，而通过下一代测序(ngs)为观察肿瘤细胞群的克隆差异提供了许多潜在的好处，这一优势一直持续到检测cfdna需更有限的敏感性和特异性才有所抵消，ngs能够在一次检测中检测到广泛的基因异常，但其由于在一定频率上可能会出现序列错误而使其检测突变的灵敏度降低。基于聚合酶链反应(pcr)的方法对dna的要求和噪音水平很低，在那些基因组变化很少而对患者分层很重要的癌症类型非常有效，但这些方法对于早期或中期疾病患者的效果不是很明显，可能是由于该时期cfdna含量很低或者所用的方法灵敏度不够好的原因。在基于crispr-cas12a的生物传感器上实现了环介导等温扩增(lamp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增技术，用于crispr-cas12a辅助生物传感器的快速、简单和敏感性检测。但通过核酸扩增的方法可能会导致假阳性结果，所以需要专门的实验设备和许多试剂，如核苷酸混合物，靶dna引物，逆转录酶等，并且试剂昂贵，实验过程耗时，可能还需要熟练的技术进行分析。大多数基于crispr-cas12a的生物传感器需要添加一些标记物进行追踪和标记目标分子(如添加荧光标记物进行荧光检测)，从而准确的捕获目标分子，然而添加这些标记物可能会影响目标分子的特性以及增加一定的费用，基于此提出了可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测。

技术实现思路

1、(一)解决的技术问题

2、针对现有技术的不足，本发明提供了可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，具备以哑铃状核酸双链结构辅助，基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，无需添加任何标记物也无需进行扩增，能达到fm级别的灵敏度等优点，解决了上述背景技术中所述的问题。

3、(二)技术方案

4、为实现上述背景技术中所述目的，本发明提供如下技术方案：可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，包括以下步骤：

5、s1：cas蛋白激活后并通过rna的方向识别和降解目标核酸序列；

6、s2：在crispr-cas系统中，目标dna激活后能任意切割单链dna(ssdna)；

7、s3：提高目标dna检测的灵敏度；

8、s4：基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测；

9、s5：多次检测避免其中检测到广泛的基因异常，cfdna检测的生物传感器系统，无需添加任何标记物也无需进行扩增，能达到fm级别的灵敏度。

10、优选的，所述s1中，聚类规则间隔短回文重复序列(crispr)系统的特性能在cas蛋白激活后并通过rna的方向识别和降解目标核酸序列，从而为细菌提供适应性的免疫，以降解入侵的核酸。

11、优选的，所述s2中，在crispr-cas系统中，crispr-cas12a具有独特的反切效应，在被目标dna激活后能任意切割单链dna(ssdna)。

12、优选的，所述s3中，在基于crispr-cas12a的生物传感器上实现了环介导等温扩增(lamp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增技术，用于crispr-cas12a辅助生物传感器的快速、简单和敏感性检测。

13、优选的，所述s4中，基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，其中哑铃状核酸双链结构作为该系统的辅助物，无需添加任何标记物，哑铃状核酸双链结构是通过pcr扩增得到两段不同长度的双链dna(dsdna)产物，然后经过一定条件孵育形成中间带有单链dna(ssdna)的哑铃形状的核酸双链结构，该结构上的单链在被激活的crispr-cas12a剪切得到两段核酸双链，而未被激活的crispr-cas12a无法识别和降解单链使得其保持原来的哑铃状核酸双链结构，最后利用玻璃纳米孔技术检测哑铃状核酸双链出峰数的变化从而检测cfdna。

14、优选的，所述s5中，ngs能够在一次检测中检测到广泛的基因异常，但其由于在一定频率上可能会出现序列错误而使其检测突变的灵敏度降低，在基于crispr-cas12a的生物传感器上实现了环介导等温扩增(lamp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增技术，用于crispr-cas12a辅助生物传感器的快速、简单和敏感性检测。

15、优选的，所述纳米孔技术是一类单分子传感器，它具有操作简单、单分子分辨率高和无需任何标记等优点，从而成为了检测dna、rna和蛋白质等分析物的强大分析工具，纳米孔技术是利用外部电场经过纳米孔从而进行分子的电动力学迁移，玻璃纳米孔有足够的选择性和高灵敏度，其制造成本低、机械稳定性好、孔径可按意愿进行调节，是通过离子电流通过玻璃纳米孔使目标分子产生易位而得到的电流堵塞，从而产生信号放大。

16、优选的，所述哑铃状核酸双链结构辅助，无需添加任何标记物的基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，当目标dna存在时，crispr-cas12a被激活和降解单链dna(ssdna)，哑铃状核酸双链结构被破坏，分解成411bp与791bp的两个片段，导致过孔信号产生明显的改变，实现目标物的检测。

17、本发明要解决的另一技术问题是提供可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，包括以下步骤：

18、s1：cas蛋白激活后并通过rna的方向识别和降解目标核酸序列；聚类规则间隔短回文重复序列(crispr)系统的特性能在cas蛋白激活后并通过rna的方向识别和降解目标核酸序列，从而为细菌提供适应性的免疫，以降解入侵的核酸；

19、s2：在crispr-cas系统中，目标dna激活后能任意切割单链dna(ssdna)；在crispr-cas系统中，crispr-cas12a具有独特的反切效应，在被目标dna激活后能任意切割单链dna(ssdna)；

20、s3：提高目标dna检测的灵敏度；在基于crispr-cas12a的生物传感器上实现了环介导等温扩增(lamp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增技术，用于crispr-cas12a辅助生物传感器的快速、简单和敏感性检测；

21、s4：基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测；基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，其中哑铃状核酸双链结构作为该系统的辅助物，无需添加任何标记物，哑铃状核酸双链结构是通过pcr扩增得到两段不同长度的双链dna(dsdna)产物，然后经过一定条件孵育形成中间带有单链dna(ssdna)的哑铃形状的核酸双链结构，该结构上的单链在被激活的crispr-cas12a剪切得到两段核酸双链，而未被激活的crispr-cas12a无法识别和降解单链使得其保持原来的哑铃状核酸双链结构，最后利用玻璃纳米孔技术检测哑铃状核酸双链出峰数的变化从而检测cfdna；纳米孔技术是一类单分子传感器，它具有操作简单、单分子分辨率高和无需任何标记等优点，从而成为了检测dna、rna和蛋白质等分析物的强大分析工具，纳米孔技术是利用外部电场经过纳米孔从而进行分子的电动力学迁移，玻璃纳米孔有足够的选择性和高灵敏度，其制造成本低、机械稳定性好、孔径可按意愿进行调节，是通过离子电流通过玻璃纳米孔使目标分子产生易位而得到的电流堵塞，从而产生信号放大；哑铃状核酸双链结构辅助，无需添加任何标记物的基于crispr-cas12a与纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，当目标dna存在时，crispr-cas12a被激活和降解单链dna(ssdna)，哑铃状核酸双链结构被破坏，分解成411bp与791bp的两个片段，导致过孔信号产生明显的改变，实现目标物的检测；

22、s5：多次检测避免其中检测到广泛的基因异常，cfdna检测的生物传感器系统，无需添加任何标记物也无需进行扩增，能达到fm级别的灵敏度；ngs能够在一次检测中检测到广泛的基因异常，但其由于在一定频率上可能会出现序列错误而使其检测突变的灵敏度降低，在基于crispr-cas12a的生物传感器上实现了环介导等温扩增(lamp)和重组酶聚合酶扩增(rpa)等核酸扩增技术，用于crispr-cas12a辅助生物传感器的快速、简单和敏感性检测。

23、(三)有益效果

24、与现有技术相比，本发明提供了可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，具备以下有益效果：

25、1、该可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，通过设计的哑铃状核酸双链结构，并以哑铃状核酸双链结构辅助，基于crispr-cas12a与高灵敏度纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，无需添加任何标记物。当目标dna存在时，crispr-cas12a被激活从而通过rna的方向识别和降解单链dna(ssdna)，这时哑铃状核酸双链结构的过孔信号频率产生明显减少，从而实现目标物的检测。

26、2、该可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，以哑铃状核酸双链结构辅助，基于crispr-cas12a与高灵敏度纳米孔技术结合用于cfdna检测的生物传感器系统，无需添加任何标记物。哑铃状核酸双链结构两端的双链dna只是一个工具手段，不需要考虑扩增方法所带来的假阳性结果。因为哑铃状核酸双链结构中间含有单链，被激活的crispr-cas12a系统可以高效率的切割单链而两端的双链dna不受到影响。

27、3、该可被激活cas剪切的哑铃状核酸双链结构用于cfdna的检测，以哑铃状核酸双链结构作为纳米孔信号载体的手段，通过crispr-cas12a降解哑铃状核酸双链结构，能实现明显信号变化的传感手段。