油菜BnaA09WRKY6基因在增加油菜种子含油量中的应用

本发明涉及生物工程，具体涉及油菜bnaa09wrky6基因在增加油菜种子含油量中的应用。

背景技术：

1、油菜是我国重要的多功能作物之一，其既能作为蔬菜又具备一定的观赏性。与此同时，高蛋白、高油脂含量的油菜籽油使得油菜也成为了我国第一大油料作物。植物油是一种重要的人类食品和动物饲料，也是生物燃料的重要原材料，且植物油由于含有不饱和脂肪酸和各种维生素具有很高的营养价值。有研究者认为，提高甘蓝型油菜种子的含油量相比于增加耕地面积可以更为有效的实现油菜籽油增产。

2、油菜种子在收获前，若角果提前开裂会导致种子休眠不完善也会影响种子含油量。chia等研究证明，在种子发育的干燥阶段，甘蓝型油菜种子内的三酰甘油会有至少10％的丢失。此外，在模式植物拟南芥中也有相似研究，germain等人发现调控拟南芥种子发育过程中β-氧化的kat2基因发生突变会导致种子内脂质减少30％，但整体植物形态与野生型无显著变化。气候环境也对油菜种子的含油量具有一定程度的影响，随着温度的升高，与脂质代谢相关基因的表达量下调，从而造成种子含油量下降，高温也会导致甘蓝型油菜花朵败育。

3、油菜种子的含油量是一个容易受到环境因素影响的复杂数量性状，可以通过分子遗传技术精准改良油菜种子的含油量。li等通过关联图谱分析，将bnaa.fae1鉴定为与种子含油量显著相关基因。zou等将酵母基因slc1-1异源表达至拟南芥及甘蓝型油菜中，转基因植株的种子含油量增加且tag中超长链脂肪酸总体比例和含量增加。ding等人研究发现在油菜中过量表达bnlacs2能够增加油菜种子的含油量，同时bnlacs2能够转录促进脂肪酸合成通路基因的表达(ding，li na，et al.″long-chain acyl-coa synthetase 2 isinvolved in seed oil production in brassica napus.″bmc plant biology，20.1(2020、)：21.)。liu等发现过表达三酰甘油合成途径中的五个基因bngpdh、bngpat、bndgat、scgpdh和sclpaat，相比于野生型，甘蓝型油菜种子含油量高达12.57％-14.46％。

4、植物种子在生长过程中由于受到关键酶基因的调控进而促进内部脂质的积累，同时也有大量研究表明，植物种子含油量的变化依赖于由转录因子为主的联合调控机制。已有大量文献证明，wrky蛋白家族在不同环境条件下的植物防御中发挥着重要的作用，也在植物激素诱导的合成代谢通路中发挥作用，然而wrky转录因子家族在种子脂质积累过程中的研究还鲜有报道。

技术实现思路

1、申请人研究发现bnaa09wrky6基因在油菜种子含油量积累过程中起着关键的作用，因此利用现代生物技术手段在油菜中构建转基因植株，将有助于培育高含油量的油菜种质资源，进而提高油菜的产量。

2、本发明提供了一个油菜bnaa09wrky6基因在提供油菜种子含油量中的应用，在油菜中敲除该基因，能够在增大油菜种子体积的同时促进种子内含油量的积累。

3、本发明的具体技术方案如下：

4、油菜bnaa09wrky6基因在增加油菜种子含油量中的应用，所述油菜bnaa09wrky6基因的碱基序列如seq id no.1所示。

5、用于增加油菜种子含油量时，将油菜中的bnaa09wrky6基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体转化到作为受体植物的油菜中进行油菜bnaa09wrky6基因的沉默或敲除。

6、利用所述的基因敲除对油菜进行遗传转化，经测试发现，bnaa09wrky6基因功能的丧失能够增加油菜种子含油量。

7、其中，所述植物表达载体为pylcrispr/cas9-dh。将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。

8、所述受体植物为甘蓝型油菜。所述油菜的品种为甘蓝型油菜westar 10，但不仅限于westar 10。

9、优选的，在进行基因敲除时，同时敲除两个靶点，序列为：

10、(1)gtggctctccgtcggcagca；

11、(2)tcgagagcatcagatgaggc。

12、本发明有提供了一种增加油菜种子含油量的方法，包括以下步骤：

13、s1：将油菜中的bnaa09wrky6基因连入植物表达载体中，构建得到沉默或敲除用的重组表达载体，其中，油菜bnaa09wrky6基因的碱基序列如seq id no.1所示；

14、s2：将重组表达载体转化到作为受体植物的油菜中。

15、其中，沉默或敲除用的载体为pylcrispr/cas9-dh。在进行基因敲除时，同时敲除两个靶点，序列为：

16、(1)gtggctctccgtcggcagca；

17、(2)tcgagagcatcagatgaggc。

18、步骤s2中，将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。

19、本发明具备的有益效果：本发明通过设计bnaa09wrky6基因的敲除靶点构建基因敲除载体，并在油菜中进行遗传转化，发现bnaa09wrky6基因功能的丧失能够增加油菜种子的含油量，有助于高含油量油菜种质资源的培育，助力油菜高产量育种的发展。

20、基于油菜与其他双子叶植物的密切关系，本发明中bnaa09wrky6基因功能的丧失能够增加种子含油量也可以应用到其他双子叶植物中增加种子含油量。

技术特征：

1.油菜bnaa09wrky6基因在增加油菜种子含油量中的应用，所述油菜bnaa09wrky6基因的碱基序列如seq id no.1所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，用于增加油菜种子含油量时，将油菜中的bnaa09wrky6基因连入植物表达载体中，构建得到重组表达载体，然后将重组表达载体转化到作为受体植物的油菜中进行油菜bnaa09wrky6基因的沉默或敲除。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述植物表达载体为pylcrispr/cas9-dh。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，在进行基因敲除时，同时敲除两个靶点，序列为：

6.一种增加油菜种子含油量的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.如权利要求6所述增加油菜种子含油量的方法，其特征在于，沉默或敲除用的载体为pylcrispr/cas9-dh。

8.如权利要求7所述增加油菜种子含油量的方法，其特征在于，在进行基因敲除时，同时敲除两个靶点，序列为：

9.如权利要求6所述增加油菜种子含油量的方法，其特征在于，步骤s2中，将重组表达载体转化农杆菌，然后用获得的重组农杆菌侵染受体植物。

技术总结
本发明公开了油菜BnaA09WRKY6基因在增加油菜种子含油量中的应用，涉及生物工程技术领域。本发明通过设计BnaA09WRKY6基因的敲除靶点构建基因敲除载体，并在油菜中进行遗传转化，发现BnaA09WRKY6基因功能的丧失能够增加油菜种子的含油量，有助于高含油量油菜种质资源的培育，助力油菜高产量育种的发展。基于油菜与其他双子叶植物的密切关系，本发明中BnaA09WRKY6基因功能的丧失能够增加种子含油量也可以应用到其他双子叶植物中增加种子含油量。

技术研发人员：甘银波,徐诺,吴敏洁,陈娜娜,杨帅淇,阿卜杜·萨拉姆,李雪平
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/3/24