一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌及其构建方法与应用

本发明属于生物，具体涉及一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌及其构建方法与应用。

背景技术：

1、通过丙酮丁醇梭菌等产溶剂梭菌进行厌氧发酵可以生产生物丁醇等溶剂，丁醇作为新型可再生液体燃料，较生物乙醇具有突出的低碳减排特性，其与汽油能量密度更接近，混合配伍性更佳，吸湿性及腐蚀性更低，与现有成品油输送和贮藏设施兼容性更好。但在厌氧发酵过程中，产溶剂梭菌细胞在对数生长后期以及稳定期开始出现大规模自溶、裂解死亡，发酵细胞密度及活细胞数难以突破或维持，加之丁醇抑制物等环境因素的毒性胁迫作用，菌体生物量、碳源利用、溶剂浓度、得率及产率等生产指标受到严重制约，此类问题亟待解决！

2、事实上，以革兰氏阳性细菌为代表的微生物，它们的细胞自溶过程是通过自溶素(autolysin)来实现的，自溶素是由革兰氏阳性细菌本身产生的能够水解细胞壁肽聚糖结构的特异性水解酶。在细菌对数生长期，自溶素精准定位于分裂隔膜，调节细胞伸长、分裂、细胞壁翻转、鞭毛运动及趋化性等活动。在细菌生长稳定期，胞外自溶素表达活性提高，致使细胞发生大规模自溶裂解，细胞内容物及抑制因子溶出，细胞进入衰亡期。

3、值得注意的是，细菌细胞壁中磷壁酸组分在调节自溶素活性方面起着重要作用。磷壁酸分为壁磷壁酸(wall teichoic acid，wta)和脂磷壁酸(lipoteichoic acid，lta)，前者不深入质膜，后者跨过肽聚糖层。当细菌处于对数生长期等自然状态时，磷壁酸和自溶素均呈电负性，两者以二价阳离子为中介，通过离子间相互作用结合，使自溶素吸附于磷壁酸阴离子聚合物内，自溶素水解活性及细胞自溶率降低；当细菌由对数生长期进入稳定期或处于胁迫环境时，细胞壁磷壁酸表达水平降低，自溶素与磷壁酸之间的离子间相互作用减弱，自溶素释放且水解活性增强，导致细胞自溶率提高并逐渐进入衰亡期。

4、因此，基于以上革兰氏阳性细菌磷壁酸结构及功能特征，可构建壁磷壁酸改造梭菌，通过强化壁磷壁酸合成以调节胞外自溶素活性，降低自溶素水解活性与细胞自溶率，弱化或缓解细胞自溶发生，提升发酵细胞密度或活细胞数。因此，开发可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌及其构建方法，实现生物丁醇等溶剂的高效发酵生产，在工业微生物领域具有潜在的理论研究意义与实际应用价值。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌及其构建方法与应用。在产溶剂梭菌内过表达壁磷壁酸合成酶编码基因，构建了壁磷壁酸改造的重组产溶剂梭菌，通过强化壁磷壁酸合成，降低胞外水解酶自溶素活性，增加厌氧发酵细胞密度或活细胞数，进而提高乙醇及丁醇等醇类溶剂浓度、得率与产率。本发明在严格厌氧微生物产溶剂梭菌中，首次过表达壁磷壁酸合成酶编码基因，促进细胞壁磷壁酸合成表达，以解决现有技术中产溶剂梭菌厌氧发酵细胞密度或活细胞数低、碳源消耗速率及利用率低、发酵生产周期长、乙醇及丁醇等溶剂浓度、得率与产率低的一系列实际问题。

2、本发明的技术方案为：

3、第一方面，本发明提供了一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌，其为重组产溶剂梭菌。通过构建壁磷壁酸合成酶过表达的表达载体，导入至包括丙丁梭菌(clostridium acetobutylicum)在内的野生或改造产溶剂梭菌中，以获得壁磷壁酸改造的重组产溶剂梭菌。

4、进一步地，壁磷壁酸合成酶编码基因核苷酸序列如seq id no.1所示，其编码的蛋白质氨基酸序列为seq id no.2。

5、seq id no.1：

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32、aaatattttactatagaggatataaaaaaatttgctgtgagaaagagttgaseq id no.2：

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41、salcyvtfvilfkyftiedikkfavrks

42、进一步地，所构建的壁磷壁酸改造梭菌，其厌氧发酵对数生长期活细胞数增加，碳源消耗速率及利用率提升，发酵丁醇等溶剂浓度、得率及产率提高，毒性抑制物及高温胁迫耐受性增强。

43、第二方面，本发明提供了上述壁磷壁酸改造梭菌的构建方法，包括以下步骤：

44、1)通过酶切连接方法，将如seq id no.1所示的壁磷壁酸合成酶编码基因核苷酸序列连接入载体质粒pimp1中，其中seq id no.1核苷酸序列的5’端连接有如seq id no.3(启动子基因thl的核苷酸序列)所示的启动子，以获得表达载体pimp1-wta；

45、seq id no.3：

46、tttttaacaaaatatattgataaaaataataatagtgggtataattaagttgt

47、tagagaaaacgtataaattagggataaactatggaacttatgaaatagattg

48、aaatggtttatctgttaccccgtatcaaaatttaggaggttagttaga

49、2)将步骤1)中获得的表达载体pimp1-wta转入e.coli dh10b中，得到甲基化的表达载体pimp1-wta；

50、3)将步骤2)中获得的甲基化的表达载体pimp1-wta导入至产溶剂梭菌内，经培养、筛选获得壁磷壁酸改造的重组产溶剂梭菌。

51、第三方面，本发明还提供了一种壁磷壁酸改造梭菌的应用，用于醇类物质发酵，其利用上述壁磷壁酸改造梭菌或利用上述构建方法获得的重组产溶剂梭菌，包括以下步骤：

52、1)活化培养：将菌种按5％(v/v)接种量接种至液体活化培养基中，置于厌氧点滴瓶中静置培养，培养温度37℃，自然ph，静置活化培养18-24h后用于种子培养；

53、2)种子培养：将步骤1)中获得的活化菌种按10％(v/v)接种量接种至液体种子培养基中，置于厌氧点滴瓶中摇瓶培养，培养温度37℃，转速100-250rpm，自然ph，振荡培养18-24h后用于发酵培养；

54、3)发酵培养：将步骤2)中获得的种子菌种按10％(v/v)接种量接种至液体发酵培养基中，置于厌氧发酵罐中搅拌培养，培养温度30-45℃，搅拌转速100-250rpm，ph为4.0-6.5，发酵培养24-72h以生产醇类物质。

55、其中，在步骤1)中，所述的液体活化培养基包含葡萄糖20g/l、胰蛋白胨30g/l和酵母粉10g/l，自然ph。

56、其中，在步骤2)中，所述的液体种子培养基包含葡萄糖70g/l、乙酸铵3.22g/l、酵母粉2.0g/l、mgso4·7h2o 0.2g/l、kh2po4 0.5g/l、k2hpo4 0.5g/l、feso4·7h2o 0.01g/l、mnso4·7h2o 0.01g/l、生物素0.01g/l、对氨基苯甲酸0.01g/l和甘油5g/l，自然ph。

57、其中，在步骤3)中，所述的液体发酵培养基包含葡萄糖70g/l、乙酸铵3.22g/l、酵母粉2.0g/l、mgso4·7h2o 0.2g/l、kh2po4 0.5g/l、k2hpo4 0.5g/l、feso4·7h2o 0.01g/l、mnso4·7h2o 0.01g/l、生物素0.01g/l、对氨基苯甲酸0.01g/l和甘油5g/l。

58、其中，在步骤3)中，通过流加稀硫酸溶液、氢氧化钾溶液或添加ph缓冲剂碳酸钙将接种后的发酵液ph控制在4.0-6.5范围。

59、在具体的实施方案中，通过流加2mol/l氢氧化钾溶液控制发酵液ph＞5.0或＞5.5，通过添加4g/l碳酸钙控制发酵液ph在4.5-6.0范围。

60、其中，在步骤3)中，通过提高温度至40-45℃，实现高温胁迫发酵。

61、进一步地，在步骤3)中，所述的发酵培养基可为添加毒性抑制物的合成培养基或木质纤维素原料毒性水解液，所述的合成培养基中添加的毒性抑制物来源于木质纤维素原料毒性水解液抑制物(有机酸类、呋喃类、酚类等)中的一种或两种以上混合，所述的水解液为木质纤维素生物质经过物理、化学、生物或联合预处理及纤维素酶酶解后获得。

62、在一个具体的实施方案中，发酵培养基添加0.45g/l甲酸作为毒性抑制物。

63、更进一步地，所述的木质纤维素原料来源于玉米秸秆、玉米芯、麦秆、稻秆中的一种或两种以上混合。

64、综上所述，本发明提供了上述可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌、上述壁磷壁酸改造的重组产溶剂梭菌的构建方法、以及利用上述改造梭菌厌氧发酵生产丁醇等溶剂的实际应用。

65、本发明的有益效果在于：本发明提供了一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌及其构建方法与应用。本发明在产溶剂梭菌内过表达壁磷壁酸合成酶编码基因，构建了壁磷壁酸改造的重组产溶剂梭菌，通过强化壁磷壁酸合成，降低胞外水解酶自溶素活性，增加厌氧发酵细胞密度或活细胞数，进而提高乙醇及丁醇等醇类溶剂浓度、得率与产率。在不同ph条件下，本发明提供的重组菌株与原始菌株相比，发酵对数生长期活细胞数最高可提高近21倍，丁醇及总溶剂浓度、得率及产率最高可分别提高33.3％、28.2％、28.6％及85.0％；在甲酸抑制物胁迫条件下，本发明提供的重组菌株与原始菌株相比，发酵碳源葡萄糖利用率由34.3％提高至100％，丁醇及溶剂浓度、得率及产率分别提高275.0％、304.8％、39.1％及305.8％；在高温胁迫条件下，本发明提供的重组菌株与原始菌株相比，发酵碳源葡萄糖利用率由84.3％提高至91.4％，丁醇及溶剂浓度、得率及产率分别提高16.8％、14.3％、5.3％及14.3％。因此，本发明提供了一种可提高厌氧发酵细胞密度的壁磷壁酸改造梭菌，有效解决了现有技术中产溶剂梭菌厌氧发酵细胞密度或活细胞数低、碳源消耗速率低、发酵生产周期长、丁醇等溶剂浓度、得率与产率低的一系列实际问题。