本发明属于银杏雌株检测，具体涉及一种银杏雌株的特异性检测靶标gb15884及应用。
背景技术：
1、银杏(ginkgo biloba l.)，银杏科、银杏属，是典型的雌雄异株植物，被称为是世界上残存的最古老的植物活化石之一，具有丰富而重要的药用、食用、生态、社会、文化及科研价值，在国内外得到广泛栽培应用。银杏叶形奇特美丽，树姿优美，是良好的园林绿化树种。银杏的种子俗称白果，是具极高经济价值的药食同源物品，大量研究也表明银杏种子含有银杏酸等多种生理药理活性，是重要的药用部位。由于银杏外种皮腐烂后有恶臭，因此不结果的雄株银杏在园林应用上优于雌株。而农业生产上希望栽植雌株银杏以收获经济价值高的白果；在杂交育种时，依据育种目的不同，有时只需要保留单一性别亲本，而根据实际生产，经济林雌雄株栽培适宜比例为20-25：1，因此，银杏种子的生产栽培与园林绿化中的资源配置都要求将银杏的雌雄株区分开来，根据各自需要进行种植。然而银杏实生苗在定植后，雌雄株需等开花后(20-50年左右)才能从肉眼上进行鉴别。
2、近年来，国内外学者在形态学、组织化学、生理生化指标、同工酶谱、染色体核型鉴定、分子标记以及特殊蛋白质表达等方面对雌雄异株银杏性别特征表现及其鉴别进行研究。钟诲文等连续4年用3钟电泳方法对银杏雌雄株及形态上尚未分化出性别的苗木进行同工酶的测定，结果显示雌雄株间过氧化物酶同工酶谱存在着有规律的特征差异，而形态上尚未分化出性别的植株幼叶钟过氧化物酶同工酶谱也有两种类型，分别与已知性别的成年雌雄株的相对应。李正理和pollock等通过研究雌雄银杏染色体核型特征表现发现银杏雌雄株的染色体在形态上是不同的。jiang等以s1478为引物对来自两个不同产地、已知性别的银杏叶基因组dna进行rapd分析获得了1个682bp仅存在于研究的所有雄性个体而不存在于雌性个体的ra dp标记，可作为区别银杏雌雄株的可靠标记。杨金华等采用sds-page技术对银杏叶片和花序进行特异蛋白质分析，发现银杏雄株叶片蛋白质有特异带，雌株叶片钟无明显蛋白质特异带，其结果表明银杏雌雄株某些基因在特意蛋白表达方面存在差异，可用于进行银杏雌雄株鉴别。但前面所述方法对于应用于生产实践中、大规模鉴别银杏雌雄株而言比较困难。
3、因此，发掘高信赖度特异性分子检测靶标并基于新靶标建立灵敏、准确的检测技术体系对鉴别银杏雌雄株具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术中银杏雌株生物学检测方法所需周期长、特异性检测靶标较少、无法大规模应用于生产等问题，本发明提供一种新的银杏雌株的检测新靶标gb15884及基于该测靶标rpa-lfd检测引物组合物。本发明的另一目的是提供上述银杏雌株的rpa-lfd检测试剂盒。
2、第一方面，本发明提供了一种银杏雌株的特异性检测靶标gb15884，所述检测标靶的dna序列如seq id no：1所示：
3、agatttctcgacttggagatctgggttctcctatggatgatcctgctag
4、atttcatgcgatacagcatcaactgtcagctataaatagtcttaatgtt
5、gggtctggaggaggcagtggcaacctggctgtcaatccaacaaataa
6、tgctttgctgctacaattgatgcagcagcagcagcagcagcaacaaa
7、agcaatgcagggggttgcgtaccctgccctctgcaggaatagttagtc
8、aaagacccgggccaaatgatattagcatgggaatctcttgtcagctac
9、ccaatactgctggacttaatggaagctggggcaatggtgcagctttgt
10、ctggctttgcttcaaatacgcattcattgggtgctcctctaagtaatac
11、gaataactccatgcagagtttaagagaaaatcttttaagagtctcaaa
12、tattgattgtaaatcaatggacatttcaattccttccgttaatgctgtca
13、ttggctccccctctcacaatctttcaacaaggaaagatctctgtttatc
14、atctgttagtgcaataaataccaacatggggaatataaatgaatgtgtt
15、ccttttgacaatgtgagacctaagtttccgattctaggtaacatgaatgttgggcttagacaggatatgaatca(seq id no：1)。
16、另一方面，本发明还提供了一种银杏雌株的特异性检测靶标gb15884，，所述检测标靶的蛋白质序列如seq id no：2所示：
17、isrlgdlgspmddparfhaiqhqlsainslnvgsgggsgnlavnptnnal
18、llqlmqqqqqqqqkqcrglrtlpsagivsqrpgpndismgiscqlpnta
19、glngswgngaalsgfasnthslgaplsntnnsmqslrenllrvsnidck
20、smdisipsvnavigspshnlstrkdlclssvsaintnmgninecvpfdnvrpkfpilgnmnvglrqdmn(seq id no：2)。
21、另一方面，本发明还提供了一种检测银杏雌株的特异性检测靶标gb15884的引物和探针组合，所述正向引物gb15884rpaf1序列如seq id no：3所示，所述反向引物g15884rpar1序列如seq id no：4所示，探针序列g15884p序列如seq id no：5所示。
22、g15884rpaf1：
23、5’-tcagctacccaatactgctggacttaatggaag-3’(seq id no：3)；
24、g15884rpar1：
25、5’-cagagatctttccttgttgaaagattgtgagag-3’(seq id no：4)；
26、g15884p：5’-ggtgctcctctaagtaatacgaataactccatgcaga gtttaagag-3’(seq idno：5)，其5’端用fam标记，3’端用c3spacer修饰，且在探针的序列中间距5’端的30bp处进行thf修饰(四氢呋喃修饰)。
27、另一方面，本发明还提供了一种检测银杏雌株的特异性检测靶标gb15884的试剂盒，至少包括1次用量的含有上述的引物和探针组合的检测溶液。
28、进一步地，所述试剂盒还包括：装有冻干酶粉的反应单元管、缓冲液buffer、去离子水、启动剂、测流层析试纸条。
29、另一方面，本发明还提供了所述的银杏雌株的特异性检测靶标gb15884、所述的引物和探针组合以及所述的试剂盒在检测银杏雌株中的应用。
30、另一方面，本发明还提供了一种检测银杏雌株的方法，其特征在于：
31、1)提取待测样本dna；
32、2)以dna为模板，利用所述的引物(seq id no：3、seq id no：4)和探针(seq idno：5)组合或本发明所述的试剂盒进行rpa扩增；
33、3)其中，所述rpa扩增：向装有冻干酶粉的0.2ml乐尚生物(lesenbio)反应单元管中加入缓冲液buffer 29.5μl，10μm的正向引物(seq id no：3)2.1μl，10μm的反向引物(seqid no：4)2.1μl，10μm的探针(seq id no：5)0.6μl，dna模板2.0μl，启动剂3.0μl加在pcr管盖内部，去离子水补足至50μl；将rpa扩增体系充分混匀，5,000×g离心10s，置于39℃金属浴上，温育4分钟，将反应管再次混匀，离心3-5s，放入水浴锅39℃继续反应30min。
34、4)应用侧流层析试纸条进行rpa扩增产物检测；
35、取rpa反应产物10μl加入90μl的去离子水进行稀释，用涡旋振荡仪充分混匀，5,000×g离心5s，将试纸条的结合垫端(箭头朝向)垂直插入管中，室温放置5min。
36、当试纸条出现一蓝一红两条带，蓝色条带位于质控区内，红色条带位于检测区，则结果为阳性，表明样本为银杏雌株；当试纸条只有质控区出现一条蓝色条带，检测区没有条带，则结果是阴性，表明样本不是银杏雌株。
37、与现有技术相比，本发明的有益效果为：
38、1)本发明提供了一个新的且高信赖度特异性分子检测靶标gb15884，为银杏雌株的检测提供了一个新的检测途径。
39、2)基于该新靶标建立灵敏、准确、高通量的rpa-lfd检测技术体系，克服了现有技术中银杏雌雄株的生物学检测方法所需周期长、费时费力、繁琐等问题以及如利用染色体随体鉴定法无法应用于生产实践、大规模鉴定银杏雌雄株，能够较好满足对银杏雌株的现场检测，对提升银杏雌株的快速分子检测研究及在银杏幼苗期即可进行性别检测具有重要作用。
40、3)采用本发明提供的检测引物组合针对银杏雌株和银杏雌株进行检测，结果显示仅有银杏雌株的检测结果为阳性，能够扩增出特异性条带，条带大小为246bp；同时，经过特异性实验证明，通过常规pcr法，通过设计一对引物(正向引物和反向引物)进行扩增的技术，最终检测银杏雌株基因组dna的灵敏度为100pg/μl。