CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法

本发明涉及微生物，具体涉及一种csz培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法。

背景技术：

1、随着全球人口的增加，水产养殖在渔业中的地位越来越重要。近年来，我国的水产养殖业向着高密度集约化方向迅速发展，在取得高产量的同时也带来了一系列的问题，如养殖动物的抗病力下降、脂肪蓄积，肉质变差等。已有的研究表明，通过补充益生菌可以有效缓解水产养殖中的水产动物抗病力下降、脂肪蓄积等问题。

2、水产动物的肠道微生物组成与畜禽动物有很大差异，如何从水产动物肠道中高效快速的分离益生菌对于开发水产用益生菌资源具有重要意义。

3、索氏鲸杆菌(cetobacterium somerae)是一种水产养殖动物肠道中的核心细菌，有研究表明鲸杆菌不仅可以通过刺激食欲来促进鱼类生长，其发酵产物也可以显著提高鱼类对病原菌的抵抗力，降低脂肪蓄积并提高机体的抗氧化能力，因此鲸杆菌可以作为一种潜在的水产益生菌。但由于鲸杆菌是一种厌氧细菌，分离培养难度大，目前未见有关于鲸杆菌的分离培养方法。

技术实现思路

1、本发明提供的一种csz培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。

2、为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明公开了一种用于鲸杆菌培养的csz培养基，每1l所述csz培养基的原料按重量份计算，包括：胨8-12g，大豆蛋白胨2-4g，酵母浸粉4-6g，牛肉粉2-2.5g，消化血清粉10-15g，牛肝浸粉1-1.5g，糖源6-10g，磷酸二氢钾2-3g，氯化钠2-4g，l-半胱氨酸0.1-0.5g，硫乙醇酸钠0.1-0.5g；ph 7.0～9.0。

4、在本发明的较佳实施方式中，所述糖源选自葡萄糖、果糖、水苏糖、蜜二糖、蔗糖或甘露糖中的一种或几种。

5、进一步的，每1l所述csz培养基的原料按重量份计算，包括：胨10g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉5g，牛肉粉2.2g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，甘露糖8g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3g，l-半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.3g；ph 8.5。

6、第二方面，本发明公开了一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，包括如下步骤：

7、(1)鲸杆菌的体内富集：将以豆粕为主要蛋白源的饲料饲喂给水产养殖动物，两周后收集肠道内容物，进行16s rrna测序，获得鲸杆菌在水产养殖动物肠道内的丰度；

8、(2)富集培养基的制备：配制如权利要求1-3中任一项所述的csz培养基，此时，csz培养基为csz液体培养基，然后，在无氧条件下灭菌，得到富集培养基；

9、(3)鲸杆菌的体外富集：收集步骤(1)中的水产养殖动物的肠道内容物，用生理盐水重悬，将重悬液转移至步骤(2)中灭完菌后的富集培养基中，合适的温度下静置培养，得到含有鲸杆菌的菌液；

10、(4)鲸杆菌的体外分离与培养：将步骤(3)中的菌液涂布于csz固体培养基，厌氧条件下进行培养，挑选固体培养基上的单一菌落，重悬于csz液体培养基中，然后吸取混有单菌落的液体，转移至步骤(2)中的富集培养基中，在合适的温度下静置培养。

11、在本发明的较佳实施方式中，步骤(2)中，在无氧条件下进行灭菌的方法为：将配制的csz液体培养基转移至玻璃厌氧管，氮吹后迅速盖上管塞，灭菌。

12、进一步的，氮吹时的氮气流速为20～60ml/min，吹气时间为2～10min，优选的，氮吹时的氮气流速为40ml/min，吹气时间为5min。

13、进一步的，步骤(3)中，在25～37℃条件下静置培养；优选的，在28℃条件下静置培养。

14、进一步的，步骤(4)中，csz固体培养基为csz液体培养基添加质量分数为1.5％的琼脂制成。

15、进一步的，本发明公开的一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，还包括：

16、(5)鲸杆菌的鉴定：取步骤(4)经过培养后的菌液，提取基因组，使用引物27f和1492r扩增细菌16s rrna基因，pcr产物进行测序，将获得的序列在ncbi网站上进行比对，并使用mega11软件构建系统进化树，确定目标菌种。

17、优选的，所述鲸杆菌为索氏鲸杆菌znn-1，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，引物27f的核苷酸序列如seq id no.2所示，引物1492r的核苷酸序列如seq id no.3所示。

18、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

19、本发明提供的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，首次创新的提出了通过饲料来富集动物体内鲸杆菌的丰度以降低分离难度，此外本发明无需在厌氧培养箱内进行厌氧培养，极大的降低了鲸杆菌的培养难度。本发明的方法在国内外尚未见报道。

技术特征：

1.一种用于鲸杆菌培养的csz培养基，其特征在于，每1l所述csz培养基的原料按重量份计算，包括：胨8-12g，大豆蛋白胨2-4g，酵母浸粉4-6g，牛肉粉2-2.5g，消化血清粉10-15g，牛肝浸粉1-1.5g，糖源6-10g，磷酸二氢钾2-3g，氯化钠2-4g，l-半胱氨酸0.1-0.5g，硫乙醇酸钠0.1-0.5g；ph 7.0-9.0。

2.根据权利要求1所述的用于鲸杆菌培养的csz培养基，其特征在于，所述糖源选自葡萄糖、果糖、水苏糖、蜜二糖、蔗糖或甘露糖中的一种或几种。

3.根据权利要求2所述的用于鲸杆菌培养的csz培养基，其特征在于，每1l所述csz培养基的原料按重量份计算，包括：胨10g，大豆蛋白胨3g，酵母浸粉5g，牛肉粉2.2g，消化血清粉13.5g，牛肝浸粉1.2g，甘露糖8g，磷酸二氢钾2.5g，氯化钠3g，l-半胱氨酸0.3g，硫乙醇酸钠0.3g；ph 8.5。

4.一种基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

5.根据权利要求4所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于：步骤(2)中，在无氧条件下进行灭菌的方法为：将配制的csz液体培养基转移至玻璃厌氧管，氮吹后迅速盖上管塞，灭菌。

6.根据权利要求4所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于，氮吹时的氮气流速为20～60ml/min，吹气时间为2～10min。

7.根据权利要求4所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于：步骤(3)中，在25～37℃条件下静置培养。

8.根据权利要求4所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于：步骤(4)中，csz固体培养基为csz液体培养基添加质量分数为1.5％的琼脂制成。

9.根据权利要求4所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于，还包括：

10.根据权利要求9所述的基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，其特征在于，所述鲸杆菌为索氏鲸杆菌znn-1，具有如seq id no.1所示的核苷酸序列，引物27f的核苷酸序列如seq id no.2所示，引物1492r的核苷酸序列如seq id no.3所示。

技术总结
本发明公开了一种CSZ培养基及基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，涉及微生物技术领域。每1L所述CSZ培养基的原料按重量份计算，包括：胨8‑12g，大豆蛋白胨2‑4g，酵母浸粉4‑6g，牛肉粉2‑2.5g，消化血清粉10‑15g，牛肝浸粉1‑1.5g，糖源6‑10g，磷酸二氢钾2‑3g，氯化钠2‑4g，L‑半胱氨酸0.1‑0.5g，硫乙醇酸钠0.1‑0.5g；pH7.0‑9.0。同时本发明提供了基于测序指导的鲸杆菌的分离与培养方法，包括(1)鲸杆菌的体内富集、(2)富集培养基的制备、(3)鲸杆菌的体外富集和(4)鲸杆菌的体外分离与培养。本发明首次创新的提出了通过饲料来富集动物体内鲸杆菌的丰度以降低分离难度，此外本发明无需在厌氧培养箱内进行厌氧培养，极大的降低了鲸杆菌的培养难度。

技术研发人员：张美玲,周楠楠,杜震宇
受保护的技术使用者：华东师范大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14