一种用于治疗高位截瘫的干细胞培养方法与流程

本发明属于生物，具体为一种用于治疗高位截瘫的干细胞培养方法。

背景技术：

1、干细胞是一类具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，当前，干细胞和再生医学的研究已成为自然科学中最为引人注目的领域，其中嗅上皮神经干细胞作为神经来源的成体干细胞在神经损伤的修复中具有独特的优越性，哺乳动物嗅黏膜损伤后可自我修复，其嗅受体神经元在整个生命期可终生维持神经组织的持续自我更新。

2、当人们的脊髓损伤后，容易造成人们高位截瘫，从而影响人们行走，而目前，为对人们的脊髓进行治疗，人们会提取大鼠嗅球上皮的嗅觉干细胞进行培养，然后通过体外分离获得大鼠的嗅觉干细胞，具有体外增殖和分化能力，并且在没有神经支持的情况下可以分化为具有活性的嗅觉细胞，通过神经干细胞移植从而治疗骨髓损伤，而在对嗅觉干细胞进行培养时，需要将嗅觉干细胞放置在无菌培养皿中并置于培养箱中进行培养，培养时需要定期向无菌培养皿中添加营养液，但是，现有技术中，在对无菌培养皿中添加营养液时，需要将培养箱打开并将无菌培养皿取出才可添加，容易造成无菌培养皿中的干细胞受到细菌感染，影响嗅上皮神经干细胞培养。

技术实现思路

1、针对上述情况，为克服现有技术的缺陷，本发明提供一种用于治疗高位截瘫的干细胞培养方法，有效的解决了目前在对无菌培养皿中添加营养液时，需要将培养箱打开并将无菌培养皿取出才可添加，容易造成无菌培养皿中的干细胞受到细菌感染，影响嗅上皮神经干细胞培养的问题。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种用于治疗高位截瘫的干细胞培养方法，包括培养箱、无菌培养皿和培养液罐，所述无菌培养皿可拆卸设置在培养箱中，所述培养箱的内部设置有转动机构并可带动无菌培养皿转动，所述培养液罐固定设置在培养箱的左侧上方，所述培养液罐的下端中部固定连接有注液管，所述注液管的另一端固定贯穿培养箱的左侧壁并延伸至无菌培养皿的上方左侧，所述培养液罐的内部还设置有自动启闭阀，所述自动启闭阀中的传动杆与转动机构中的转杆相互传动，所述培养箱的前侧通过铰链转动连接有箱门，还包括以下步骤：

3、s1、嗅上皮组织获取，选取健康的若干雄性大鼠，并通过co2对大鼠致死，然后断头后在显微镜下采用显微镊取下大鼠的嗅上皮组织，并将获取的嗅上皮组织放入盛有解剖液的试管中；

4、s2、制备单细胞悬液，在试管中放入含2.4u/ml中性蛋白酶pbs溶液中37℃消化45min，pbs溶液中止消化，在显微镜下，用显微器将嗅上皮的上皮层和固有层分离，分别放入pbs溶液中，上皮层组织放入含10μg/ml dna酶和0.125％胰酶消化10mim，固有层组织0.25％ⅰ型胶原酶37℃消化10min，将固有层及上皮层合并后，火焰抛光的巴尔德斯管轻轻吹打，再通过1000r/min离心10min，制得含10％fbs的dmem/f12的溶液重悬细胞；

5、s3、细胞培养，将s2中的重悬细胞放入准备好的无菌培养皿中，并将无菌培养皿放置在培养箱中进行培养，并通过培养液罐向无菌培养皿中添加培养液，获得需要的嗅上皮神经干细胞。

6、优选的，所述转动机构包括伺服电机、转杆、支撑板和支撑轴，所述支撑板横向固定设置在培养箱的内部下方，所述培养箱通过支撑板分为培养腔和加热腔，所述加热腔的内部设置有水浴加热机构，所述伺服电机固定设置在培养箱的上内侧壁中部，且伺服电机的输出端通过联轴器与转杆的上端固定连接，所述支撑轴通过第一轴承转动设置在支撑板的上侧中部，所述无菌培养皿可拆卸设置在转杆和支撑轴之间。

7、优选的，所述无菌培养皿的上下两侧中部分别固定连接有第一圆柱和第二圆柱，所述第一圆柱和第二圆柱相反的两端分别固定连接有第一方形插杆和第二方形插杆，所述转杆的下端开设有圆槽，所述圆槽的内部滑动设置有圆杆，所述圆杆的上端固定连接有弹簧，所述圆槽的侧壁开设有两个对称分布的滑块，两个所述滑块均与圆杆的杆壁上端固定连接，所述圆杆的下端中部开设有可供第一方形插杆滑动插入的第一方形插槽，所述支撑轴的上端中部开设有可供第二方形插杆滑动插入的第二方形插槽。

8、优选的，所述无菌培养皿的内部固定连接有*型隔板并通过*型隔板分为多个培养槽。

9、优选的，所述水浴加热机构包括电加热棒，所述电加热棒固定设置在加热腔的内部，所述支撑板的上侧开设有多个均匀分布的透气孔，每个所述透气孔的内部均固定设置有透气海绵，所述加热腔的右侧下方固定连接有换水管，所述换水管上设置有控制阀；

10、优选的，所述自动启闭阀包括第一阀板、第二阀板、第三阀板和传动组件，所述第一阀板和第三阀板均横向设置在培养液罐的内部下方，且第三阀板的下侧和培养液罐的下内侧壁之间利用空隙，所述第二阀板横向设置在第一阀板和第三阀板之间，且第二阀板的上下两侧分别与第一阀板及第二阀板相抵并可进行滑动，所述第二阀板的上端中固定插接有驱动杆，所述驱动杆的上下两端均通过第二轴承分别与第一阀板及第三阀板转动连接，所述驱动杆的上端延伸至第一阀板的上侧，所述传动组件设置在培养液罐中，所述转杆通过传动组件可带动驱动杆转动，所述第一阀板、第二阀板及第三阀板的上表面分别开设有多个第一进液孔、多个第二进液孔及多个第三进液孔，多个所述第一进液孔与多个第三进液孔错位设置。

11、优选的，所述传动组件包括传动杆、第一锥齿轮、第二锥齿轮、直齿轮及冠齿轮，所述传动杆横向设置在培养液罐中，且传动杆的左端与第一锥齿轮固定连接，所述驱动杆的上端与第二锥齿轮固定连接，所述第一锥齿轮与第二锥齿轮啮合，所述传动杆的右端通过第三轴承与培养液罐的右侧壁及培养箱的左侧壁转动连接，且传动杆的右端延伸至培养箱的内部并与直齿轮固定连接，所述冠齿轮与转杆的杆壁固定套接，所述冠齿轮与直齿轮啮合连接。

12、优选的，所述箱门上设置有透明观察窗，所述培养液罐的前侧设置有透明刻度板。

13、本发明的技术效果和优点：

14、1、在将嗅上皮神经干细胞放入培养箱中进行培养时，需要添加培养液时，启动伺服电机，伺服电机带动转杆转动，转杆带动无菌培养皿转动，同时，转杆在转动时还会带动冠齿轮转动，冠齿轮带动直齿轮转动，直齿轮带动传动杆转动，传动杆带动第一锥齿轮转动，第一锥齿轮带动第二锥齿轮转动，第二锥齿轮带动驱动杆转动，驱动杆带动第二阀板转动，由于培养液罐中的营养液会进入第一阀板上的多个第一进液孔中，当第二阀板转动使其上的多个第二进液孔分别与多个第一进液孔对齐时，营养液进入多个第二进液孔中，此时多个第二进液孔与多个第三进液孔错位，第二阀板继续转动，当多个第二进液孔分别与多个第三进液孔对齐时，营养液进入多个第三进液孔中，从而能够使营养液流入注液管中并通过注液管流入无菌培养皿中，且由于无菌培养皿持续转动，能够对无菌培养皿中进行均匀添加营养液，不需要将无菌培养皿取出添加，避免无菌培养皿中的干细胞受到细菌污染，当不需要添加营养液时，伺服电机停止工作，第二阀板停止转动，且第二阀板上的多个第二进液孔无法同时与多个第一进液孔及多个第三进液孔对齐，从而能够停止添加营养液。