一种使用胚胎干外泌体激活T细胞增殖的方法与流程

本发明涉及t细胞培养领域，具体地说是一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法。

背景技术：

1、多种细胞在正常及病理状态下均可分泌外泌体，且外泌体天然存在于体液中，如血液、唾液、尿液、脑脊液和乳汁中。外泌体被视为特异性分泌的膜泡，参与细胞间的通讯，同时，外泌体还可以转移蛋白质、mrna、micrornas以及其他生物活性分子到受体细胞，并影响其生物学特性。

2、中国专利cn109498652b公开了一种诱导型调节性t细胞来源的外泌体itregexo的应用，具体为其在治疗类风湿关节炎的药物中的应用。其发明的itreg exo能够携带mir-449a-5p，进而抑制th1、th17细胞的增殖和分化，逆转类风湿关节炎小鼠中抑炎细胞treg/炎症细胞th17比例的不平衡，从而实现抑制炎症反应，缓解临床症状的效果，但是其是通过外泌体携带mir-449a-5p的方式实现对t细胞进行调节的效果，而不是直接使用外泌体。

3、又如中国专利cn116286948a公开的一种可活化t细胞的盐藻外泌体组合物的制备方法，该方法包括利用含有okt3和mesothelinscfv分子的抗cd3-m盐藻外泌体组合物、以及含有cd28scfv和mesothelinscfv分子的抗cd28-m盐藻外泌体组合物，在促进剂小分子的辅助作用下，对体内t细胞进行活化；该外泌体组合物制备方法简单，且经济成本低，给予其生存所需盐分和少量营养成分即可大规模培养并获得大量外泌体；同时联合使用可以有效靶向活化肿瘤微环境中t细胞，并对肿瘤生长有明显抑制作用。但是其抗cd3-m盐藻外泌体的制备是通过编码okt3分子和mesothelinscfv分子的基因导入载体，构建重组质粒的方式，而使用基因重组的方式，在操作上不仅仅过于繁琐，而且很可能导致基因突变的情况发生。

4、现有使用外泌体对t细胞进行活化的方式主要有两种，一是通过外泌体携带mir-449a-5p的方式，二是通过对外泌体进行基因重组的方式；然而这两种方式，均是通过外泌体组合其他物质的方式，其制备的外泌体本身并不能实现对t细胞的活化。因此，急需设计一种新的外泌体制备方式，并使用其制备的外泌体实现t细胞的活化就显得尤为重要。

技术实现思路

1、现有的外泌体并不能依靠其自身实现t细胞的活化，只能以组合物的形式来促进t细胞的活化，针对此问题，本申请设计了一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，以求设计一直新的外泌体制备方法，并通过制备的外泌体直接实现t细胞在体外未激活状态下的增殖活化。

2、一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，包括以下步骤：

3、步骤s1、制备hesc生长培养基；

4、步骤s2、将lamin521基质胶用含钙镁的dpbs稀释后，加到培养板中，并置于培养箱包被；

5、步骤s3、将hesc-h1种于基质胶包被的培养板中，使用mtesr1培养基培养，每天换液；

6、步骤s4、待细胞长至50％以上时，收集培养基上清；

7、步骤s5、待细胞长至约70％～80％融合时，进行传代；

8、步骤s6、对胚胎干细胞外泌体进行分离提取纯化；

9、步骤s7、使用步骤s6提取的胚胎干细胞外泌体对t细胞进行增殖诱导。

10、优选地，所述步骤s1的具体方法包括：

11、步骤s101、在室温融化或4℃过夜融解mtesr15×添加剂；

12、步骤s102、将解冻的mtesr15×添加剂完全混匀后加入到mtesr1基础培养基中；

13、步骤s103、待彻底混匀后，分装，并以-20℃保存。

14、优选地，步骤s2中，lamin521基质胶与含钙镁的dpbs的稀释比例为1∶7～1∶13。

15、优选地，所述步骤s6的具体方法包括：

16、步骤s601、将收集而来的细胞上清液经过0.22um的滤网进行过滤；

17、步骤s602、将过滤后的上清液至于30kd超滤管，12000g4℃离心45分钟，收集浓缩液；

18、步骤s603、将浓缩液通过qev细胞外囊泡(外泌体)分离柱分离外泌体，收集20～200nm的外泌体，进行冻干分装后，在-80℃环境下保存。

19、优选地，所述步骤s7的具体方法包括：

20、步骤s701、用低吸附的培养板进行t细胞培养，培养基为1640培养基；

21、步骤s702、添加10％fbs，添加1mg/ml的胚胎干细胞外泌体；

22、步骤s703、每3天换液一次。

23、优选地，步骤s102中，所述mtesr15×添加剂与mtesr1基础培养基的混合比例为1∶3～1∶5。

24、优选地，步骤s2中，所述培养箱包被的温度设置为37℃，包被时间为1h。

25、优选地，，步骤s3中，将hesc-h1种于基质胶包被的培养板中，每孔铺板40万。

26、优选地，所述步骤s5的具体方法包括：

27、步骤s501、吸去培养液，用dpbs洗涤细胞后，加入versene，37℃消化；

28、步骤s502、吸去versene，将mtesr1用移液枪垂直于培养板以画圈的动作打入孔中，将细胞聚集体吹下，进行传代。

29、本申请的优点和效果如下：

30、本申请设计的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，首先将lamin521基质胶用含钙镁的dpbs稀释后，制备基质胶包被；然后将hesc-h1种于基质胶包被的6孔板中，并使用mtesr1培养基进行培养；最后待细胞长至50％或以上时，继续培养24小时后收集培养基上清，用超滤离心法提取胚胎干细胞的外泌体。通过上述方法制得的胚胎干外泌体，可直接用于非活化t细胞的增殖，并且能够促进cd4+/cd8+细胞的比例增加。

31、上述说明仅是本申请技术方案的概述，为了能够更清楚了解本申请的技术手段，从而可依照说明书的内容予以实施，并且为了让本申请的上述和其他目的、特征和优点能够更明显易懂，以下以本申请的较佳实施例并配合附图详细说明如后。

32、根据下文结合附图对本申请具体实施例的详细描述，本领域技术人员将会更加明了本申请的上述及其他目的、优点和特征。

技术特征：

1.一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤s1的具体方法包括：

3.根据权利要求1或2任一项所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，步骤s2中，lamin521基质胶与含钙镁的dpbs的稀释比例为1∶7～1∶13。

4.根据权利要求3所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤s6的具体方法包括：

5.根据权利要求4所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤s7的具体方法包括：

6.根据权利要求2所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，步骤s102中，所述mtesr15×添加剂与mtesr1基础培养基的混合比例为1∶3～1∶5。

7.根据权利要求3所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，步骤s2中，所述培养箱包被的温度设置为37℃，包被时间为1h。

8.根据权利要求1或2任一项所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，步骤s3中，将hesc-h1种于基质胶包被的培养板中，每孔铺板40万。

9.根据权利要求1或2任一项所述的一种使用胚胎干外泌体激活t细胞增殖的方法，其特征在于，所述步骤s5的具体方法包括：

技术总结
本发明公开了一种使用胚胎干外泌体激活T细胞增殖的方法，包括：步骤S1、制备hESC生长培养基；步骤S2、将Lamin521基质胶用含钙镁的DPBS稀释后，加到6孔板中，并置于培养箱包被；步骤S3、将hESC‑H1种于基质胶包被的6孔板中，使用mTeSR1培养基培养，每天换液；步骤S4、待细胞长至50％或以上时，收集培养基上清；步骤S5、待细胞长至约70％～80％融合时，进行传代；步骤S6、对胚胎干细胞外泌体进行分离提取纯化；步骤S7、使用胚胎干细胞外泌体对T细胞进行增殖诱导。通过上述设计，本申请实现了使用胚胎干细胞外泌体促进免疫T细胞在体外未激活状态下的存活和增殖。

技术研发人员：陈宇
受保护的技术使用者：厚晌生物科技（苏州）有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15