一种抗体Fab片段的二聚体、其制备方法及应用

本发明涉及生物，具体地，本发明涉及一种抗体fab片段的二聚体、其制备方法及应用。

背景技术：

1、抗体由b细胞接受抗原刺激后增殖分化生成的浆细胞产生，具有与抗原特异性结合的功能。抗体结构由决定抗原结合能力的fab区和诱导抗体依赖性细胞毒作用(adcc)、补体依赖性细胞毒作用(cdc)的fc区组成，但fc片段容易引起非特异性的结合，对于临床诊断和治疗存在不利的影响。相比于完整抗体，无fc片段的小分子抗体药物具有以下优势：特异性强；分子量较小，更容易进入肿瘤组织内部；可在大肠杆菌中表达，成本低，周期短；免疫原性弱等。常见的单价小分子抗体如抗原结合片段fab、单链可变区片段scfv、可变区片段fv、单域抗体等，但由于单价小分子抗体存在着分子量低，极易被清除，半衰期较短，且亲和力较低的缺点，在实际应用中有必要设计多价小分子抗体，如双链抗体(diabody)、三链抗体(triabody)等。多价抗体可以结合多个抗原表位，相比于单价抗体，有更高的亲和力和较慢的解离速度，并且有些抗体的多价结合还可引起受体交联，激发细胞内信号转导，激活细胞或者诱导细胞凋亡等生物学效应。多价抗体的形成可通过交联方式连接，如fab段可通过基因工程linker连接成二聚体、三聚体等，也可通过自聚化结构域而形成，最终增加抗体分子大小，提高抗体药物在体内的半衰期。随着小分子抗体药物深入研究，其在临床应用中愈加广泛，如连接毒素药物可用于肿瘤的治疗，另外在抗感染治疗、器官移植、变态反应性疾病等方面，小分子抗体药物也显示了较好的应用前景，因此将单价小分子抗体改建为多价抗体已成为抗体药物研发的趋势。

2、现有技术中对抗体fab片段的改构策略为引入(cpp)3序列，但利用该方法获得的二聚化抗体比例低，无法达到大规模生产的要求。因此，急需寻找到一种新的抗体fab片段的二聚体来解决上述问题。

技术实现思路

1、解决的技术问题：

2、本发明的一个方面，是针对现有技术中抗体fab片段二聚化方法的二聚体产率低，对靶细胞的亲和力弱的缺点，提供了一种抗体fab片段的二聚体、其制备方法及应用。

3、具体地，本公开中的技术方案通过在抗体fab段的ch1的c末端引入氨基酸序列(cp)n，其半胱氨酸氧化成二硫键，从而促使fab片段二聚化，最终形成同源二价抗体分子。

4、本发明提供的技术方案：

5、一种抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，

6、其中，所述n＝1、2、3、4或5。

7、作为优选，在本公开的某些实施方式中，上述n＝1、2或3。更优选地，在本公开的一个实施方式中，上述n＝3。在本公开中，所述氨基酸序列(cp)n为包含n个cp重复单元的氨基酸序列，即，例如，cpcp、cpcpcp、cpcpcpcp、cpcpcpcpcp，在每个cp重复单元之间也可以插入至少一个与二聚化效果无关的氨基酸残基。在本公开的某些实施方式中，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n。在本公开的另一些实施方式中，所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地通过连接体(linker1)与所述氨基酸序列(cp)n连接，其目的和手段可以是现有技术中已知的，例如，增加富含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性肽连接体以增加所述二聚体的柔性，等。

8、在本公开的某些实施方式中，所述二聚体可以为同源二聚体，也可以为异源二聚体。所述同源二聚体或异源二聚体可以在单体fab片段形成后，自发地或人工地组装成二聚体。可以利用现有技术中合适的方法实现上述组装，示例性的例子如，将包含不同单体fab片段基因序列的载体在同一表达系统中进行表达，所获得的表达产物中包含有由不同单体fab片段组装形成的异源二聚体。

9、在本公开中，由所述单体fab片段形成的二聚体之间可以通过任意合适的共价键或非共价键连接。作为优选，在本公开的某些实施方式中，所述单体fab片段之间通过二硫键连接。

10、在本发明的某些实施方式中，示例性的技术方案，例如：

11、一种抗cd19抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，

12、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。

13、再例如：

14、一种抗cd20抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，

15、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。

16、再例如：

17、一种抗bcma抗体fab片段的二聚体，所述抗体fab片段包括vl、vh、cl和ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，所述单体fab片段的ch1部分的c末端直接地连接氨基酸序列(cp)n，或所述单体fab片段的ch1部分的c末端间接地经过至少一个连接体连接所述氨基酸序列(cp)n，

18、其中，所述n＝1、2、3、4或5；优选地，所述n＝3。

19、在本公开中，通过上述技术方案能够实现抗体fab片段的二聚化。为了更好地发挥fab段二聚体的某些功效，在本公开的某些实施方式中，所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还可以直接地连接效应分子，或所述氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基还可以间接地经过至少一个连接体(linker2)连接所述效应分子。经过连接体(linker2)连接的目的和手段可以是现有技术中已知的，例如，增加富含甘氨酸(g)和丝氨酸(s)的柔性肽连接体以增加所述二聚体的柔性，等。

20、在本公开的某些实施方式中，所述效应分子可以为抗癌剂、抗炎剂、抗自身免疫性疾病剂、抗感染剂、毒素、放射治疗剂、核苷酸或细胞因子。作为优选，在本公开的一些实施方式中，所述效应分子为tnf家族成员或力达霉素中的辅基蛋白ldp。在本公开中，上述效应分子可以为蛋白质、核酸或小分子化合物，其与所述二聚体连接的手段可以为现有技术中合适的方法。所述效应分子示例性的例子如，trail，肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体trail也称cd253或tnf10，是tnf超家族的成员。trail是一种ii型糖蛋白，由281个氨基酸组成，其中c端的241个氨基酸在胞外，胞外部分降解后形成有功能性的可溶性的trail。trail的第230位置为半胱氨酸，通过zn2+形成有活性的同源三聚体，与dr4、dr5受体结合，dr4和dr5为激动型受体，具有胞浆死亡结构域，当trail与其结合时可诱导胞内死亡结构域三聚化，形成死亡信号复合物，启动凋亡信号转导通路进而诱导肿瘤细胞凋亡，trail的强抗肿瘤特性可作为抗体偶联药物中的毒性蛋白在临床应用中具有极大的开发前景。在本公开的一些实施方式中，通过将trail直接或间接地与本公开所述二聚体的氨基酸序列(cp)n的末位脯氨酸残基连接，实现了trail的二聚化，经活性鉴定，该二聚体具有优秀的靶细胞体外杀伤能力。

21、在本公开中，所述抗体fab片段包括vl和vh部分，其作用为特异性结合靶蛋白。因此，所述抗体fab片段的vl和vh部分也可以替换为其他特异性结合靶蛋白的蛋白质片段。在本公开的某些实施方式中，所述蛋白质片段为特异性结合靶蛋白的配体、受体、scfv、fv或dab，或所述配体、受体、scfv、fv、dab的多价体。

22、本发明的另一个方面，是提供了一种抗体fab片段二聚化载体的构建方法，所述fab片段包括设置于所述片段c末端的重链恒定区ch1部分，所述二聚体包括两个单体fab片段，在载体中设置编码所述单体fab片段的核苷酸序列，在所述核苷酸序列的3’末端直接或间接地设置编码(cp)n的核苷酸序列；

23、其中，所述n＝1、2、3、4或5；

24、其中，所述间接地为经过编码至少一个连接体的核苷酸序列设置所述编码(cp)n的核苷酸序列。

25、本发明的另一个方面，是提供了一种抗体fab片段二聚化的方法，包括：

26、步骤a)利用上述构建方法获得包含编码所述抗体fab片段的核苷酸序列的载体；

27、步骤b)将步骤a)获得的载体在表达系统中表达并纯化。

28、本发明的另一个方面，是提供了上述二聚体在制备治疗肿瘤、炎症、自身免疫性疾病或感染的药物中的用途。

29、本发明的另一个方面，是提供了二聚体在制备抗体药物缀合物中的用途。

30、本发明的有益效果：

31、本发明提供的新型抗体二聚化改构方式，通过在抗体fab段的ch1的c末端引入氨基酸序列(cp)3，其中半胱氨酸氧化成二硫键促使fab片段二聚化，最终形成同源二价抗体分子。本发明改构方式与现有的二聚化技术，即引入(cpp)3相比，所形成的二聚化抗体比例显著提高，未来可应用于抗体片段的二聚化及抗体偶联药物的二聚化。