与花生含油量相关主效数量性状基因位点qCOA08_1及其应用

本发明涉及分子生物学，尤其是一种与花生含油量相关主效数量性状基因位点及应用分析。

背景技术：

1、花生作为人类优质食用油的重要来源，已在100多个国家广泛种植。根据faostat(http://faostat3.fao.org/)公布的数据，全球花生荚果的年产量已经超过4400万吨，而中国占全球花生产量的38％，是世界上最大的花生生产国。即便如此，国内的花生产量仍然难以满足日益增长的食用花生油需求，而且由于中国现有耕地有限，通过增加耕地来增加花生产量是不现实的。据报道，花生含油量每增加1％，油脂加工的经济效益就会增加7％(shasidhar et al.2017)。因此，提高花生单产和含油量以缓解不断增长的需求一直是全球花生育种计划的主要目标。

2、然而，几乎所有作物的产量和品质性状都是复杂的，数量性状受到遗传和环境因素的很大影响(baring et al.2013；wilson等，2013；cui等，2020；chen等人2019)。例如，chen等人(2019)估计了多种环境下的几种产量相关性状。供试产量相关性状的遗传力在0.34～0.93之间，方差分析结果显示ril群体间、环境间及ril×环境互作均存在显著差异。在某些情况下，这些连续的数量性状和交替株系之间的边际变异会使田间试验中很难区分表现最好的株系。因此，弄清遗传力和遗传方式，有利于育种人员制定育种策略。目前，油脂含量的测定需要比较困难的过程，只有在收获后才能进行。在这种情况下，传统的提高含油量的育种策略被认为是一项成本高、效率低、耗时长的工作。在现代育种中，通过标记辅助选择(marker-assisted selection,mas)可以在早期快速从种质资源中选择感兴趣的性状，且不受复杂环境的影响。mas在培育具有一些复杂数量性状的优良作物方面取得了许多成功，如棉花、水稻和普通大豆(tian et al.2021；hulsekemp et al.2015；shi等。2021)以及动物育种中(chen等。2022)。然而，mas的建立必须在特定的、有用的基因或qtl定位成功的条件下进行。

3、为了实现mas育种目标，育种家们一直在努力寻找有价值的qtl。在世界各地的许多情况下，确定花生油含量的qtl并开展有针对性的育种工作，将是旨在确保人类食用油供应的项目的重要组成部分。遗憾的是，尽管育种家已经认识到mas育种的重要性，但挖掘遗传资源提高花生油含量的研究明显滞后于大豆等其他油料作物，尤其是功能基因的克隆。由于花生品种缺乏相关的有利基因资源，利用mas选育高油花生品种仍难以实现。因此，探索遗传资源，进一步通过图位克隆方式获得增加籽粒含油量有利基因，可以促进花生mas育种，加快育种进程。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是提供一种一种与花生含油量相关主效数量性状基因位点及其应用。

2、为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案如下。

3、一种筛选与花生含油量相关的基因的方法，利用全基因组序列分析筛选候选基因，首先对两个亲本花生品种冀花5号jh5和开选01-6kx01-6进行基因组变异的比较，经过筛选在jh5和kx01-6两个候选区域之间识别出高质量的可变snps和indels，去除分布在内含子、基因间区域和编码区下游及其他不能导致功能缺失的变异，保留分布在5'-utr、3'-utr、上游、剪接和外显子编码区的变异，所得变异对应的基因确定为候选基因。

4、一种筛选与花生含油量相关的基因的方法，通过转录组分析筛选候选基因，检测qcoa08_1和qcoa08_2两个候选区间中所有基因在油脂代谢关键期的表达模式，候选区间的全部基因作为候选基因，首先将在两个亲本花生品种冀花5号jh5和开选01-6kx01-6中均未表达的候选基因去除，这些基因不作为qcoa08_1和qcoa08_2的效应基因，剩余候选基因根据倍数变化和p值检测差异表达，检测标准为：倍数变化为log2fc≥1或≤-1，p指为p<0.001；即可得到qcoa08_1和qcoa08_2候选区间为数不多的差异表达基因degs，然后从所得差异表达基因degs中筛选强候选基因，经过试验验证或文献验证得到最终的候选基因或候选基因小组。

5、作为本发明的一种优选技术方案，所述强候选基因为花生ah.uvri66基因，其编码乙烯转录因子wrinkled 1wri1。

6、作为本发明的一种优选技术方案，所述ah.uvri66基因的fpkm值在低含油量品种kx01-6中为4.65，而ah.uvri66在高含油量品种jh5中表达量为22.03，为低油品种的5倍。

7、作为本发明的一种优选技术方案，所述ah.uvri66基因表达差异的分子来源在于启动子区主导的基因表达模式变异。

8、作为本发明的一种优选技术方案，所述ah.uvri66的启动子区在748和749核苷酸之间存在一个6bp atatat的插入，对应花生亲本之间含油量表达差异的分子来源或候选分子来源。

9、一种与花生含油量相关的主效qtl，所述主效qtl命名为qcoa08_1和/或qcoa08_2，所述qcoa08_1位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为chr.08_38056541-chr.08_40978133；所述qcoa08_2位于花生基因组的第8个连锁群中，其标记区间为chr.08_44887537-chr.08_46776535。

10、所述主效qtl的用途，用于开发与花生含油量相关的分子标记及其引物。

11、所述主效qtl的用途，用于花生含油量相关的分子标记辅助育种。

12、主效qtl的用途，基于所述主效qtl开发紧密连锁分子标记，通过专用的dcaps标记识别所述紧密连锁分子标记，由此识别待测花生植株是否为对应的基因型，实现高含油量花生的分子标记辅助育种。

13、用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效qtl qcoa08_1下游侧翼序列的分子标记chr.8_46776535，其核苷酸序列依次如seq id no.1所示。

14、用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dcaps引物，包括：对应于分子标记chr.8_46776535的dcaps-f和dcaps-r引物对，其核苷酸序列依次如seq id no.2和seq id no.3所示；对应的酶切位点为ecori，对应的识别序列为gaattc。

15、用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效qtl qcoa08_1上游侧翼序列的分子标记chr.8_44887537，其核苷酸序列依次如seq id no.4所示。

16、用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dcaps引物，包括：对应于分子标记chr.8_44887537的dcaps-f和dcaps-r引物对，其核苷酸序列依次如seq id no.5和seq id no.6所示；对应的酶切位点为bsrbi，对应的识别序列为gagcgg。

17、用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效qtl qcoa08_2上游侧翼序列的分子标记chr.8_38056541，其核苷酸序列依次如seq id no.7所示。

18、用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dcaps引物，包括：对应于分子标记chr.8_38056541的dcaps-f和dcaps-r引物对，其核苷酸序列依次如seq id no.8和seq id no.9所示；对应的酶切位点为foki，对应的识别序列为ggatg。

19、用于花生含油量性状识别的分子标记，为关联于主效qtl qcoa08_2下游侧翼序列的分子标记chr.8_40978133，其核苷酸序列依次如seq id no.10所示。

20、用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的dcaps引物，包括：对应于分子标记chr.8_44887537的dcaps-f和dcaps-r引物对，其核苷酸序列依次如seq id no.11和seq id no.12所示；对应的酶切位点为hindiii，对应的识别序列为aagctt。

21、用于鉴定或辅助鉴定花生含油量性状的试剂盒，通过检测花生主效qtl qcoa08_1或qcoa08_2的多态性，用于花生含油量相关的分子标记辅助育种。

22、作为本发明的一种优选技术方案，所述试剂盒包含序列表中seq id no.2和seqid no.3组成的dcaps引物对，和/或序列表中seq id no.5和seq id no.6组成的dcaps引物对，和/或序列表中seq id no.8和seq id no.9组成的dcaps引物对，和/或序列表中seq idno.11和seq id no.12组成的dcaps引物对

23、所述的试剂盒、引物或分子标记，在花生分子育种中用于鉴定或辅助鉴定花生的含油量性状。

24、采用上述技术方案所产生的有益效果在于：本发明基于ril群体构建了包含2840个多态性snp标记的高分辨率遗传图谱，并在6个环境中稳定检测到2个效应较大的有价值qtl位点qcoa08_1和qcoa08_2。根据侧翼标记物的物理位置，qcoa08_1和qcoa08_2的物理间隔被定位在～2.9mb和～1.7mb之间。同时进行全基因组重测序和转录组分析，将候选基因的数量限定在40个以内。而一个编码wri1转录因子并在亲本间表现出不同表达模式的强候选基因。本发明为花生优异等位基因的克隆提供了实用基础，与qcoa08_1和qcoa08_2紧密连锁的多态snp标记或开发的dcaps标记有助于加快mas的育种进程。