一种分化海马齿状回类器官的诱导方法与应用

本发明涉及生物，具体涉及一种分化海马齿状回类器官的诱导方法与应用。

背景技术：

1、伴随全球老龄化问题日益严重，阿尔茨海默症(alzheimer's disease,ad)和其他形式的痴呆症跻身全球第七大死因(2019年世卫组织数据)，目前没有有效的治疗方法。ad领域的新药开发不仅耗费高经费，在临床试验阶段的失败率还居高不下。多种痴呆症常常伴随有海马体的神经退行性病变。海马则是人脑边缘系统中的关键脑区，负责人的记忆和学习功能，而齿状回(dentate gyrus,dg)是海马最重要的结构之一，参与海马的记忆、空间定位等功能。

2、近二十年来兴起的大脑类器官(brain organoid)技术，解决了在科学研究中人脑组织资源有限以及伦理等关键问题，为研究大脑发育和神经退行性疾病提供了平台。与多个大脑区域相关的类器官相继被开发，如皮层、中脑、小脑、脉络从类器官等，而与记忆、学习等重要功能相关的海马类器官还未真正被开发出来。目前，体外开发海马类器官主要是激活wingless and int-1(wnt)通路：直接在培养液中连续20天添加wnt3a生长因子来分化拟胚体，再与星形胶质细胞同培养，最后获得局部少量表达dg区标志物神经元的海马类器官；使用chir99021和另一个bmp4生长因子短期诱导拟胚体，生长端脑中背部的类器官(dorsomedial telencephalon organoid,dmt organoid)，再长期培养dmt类器官一百多天后获得少量表达dg区标志物的神经元；连续90天使用wnt通路的激活剂chir99021，结合脑源性神经生长因子(brain-derived neurotrophic factor，bdnf)一同诱导，最后同样获得局部少量表达dg区标志物神经元的海马类器官；在诱导皮层类器官的方案中，添加少量wnt3a生长因子成功诱导出少量表达海马其他区(海马角，cornu ammonis，ca)标志物的神经元的类器官。

3、但以上技术均存在缺陷，首先，采用在dmt类器官培养海马神经元的方案，无法获得结构稳定且能长期培养的大脑类器官。dmt类器官中还会形成脉络从结构，脉络从会抑制神经的发育和生长。因此，只能将dmt类器官消化形成单细胞悬浮液，再通过传统的二维培养环境长期培养以获得海马神经元，已不具备三维类器官作为体外模型的优势。其次，仅采用激活wnt信号通路的方案，虽能够在体外开发出能长期培养的大脑类器官，但在这些类器官中仅有局部少量细胞表达海马dg或ca标志物，其电生理特性也并未得到很确定地表征。缺乏海马神经元的海马类器官，影响与海马相关的神经疾病体外建模，降低该模型模拟神经疾病病理的相似度，不利于对神经疾病形成机制的深度挖掘。最后，利用这些海马类器官建立的疾病模型，都是基于本身具有神经疾病的病人的细胞衍生的诱导性多能干细胞(human induced pluripotent stem cells,hipscs)，但散发性ad的占比(约95％)远远高于家族性ad(约5％)。因此，这些海马类器官还无法真正模拟散发性神经疾病的病理。

4、针对目前海马类器官中海马神经元较少、相关疾病模型仅为家族性神经疾病等缺陷，亟需开发一种分化海马齿状回类器官的诱导方法与应用，为研究ad病理和药物筛选提供一个有用的平台。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种分化海马齿状回类器官的诱导方法与应用。该方法诱导分化的海马齿状回类器官包含大量的海马祖细胞神经元和dg区颗粒神经元，并具有功能性的突触结构，具有信号传输功能的基本条件。

2、本发明的第一方面提供一种分化海马齿状回类器官的诱导方法。

3、具体的，所述诱导方法包括以下步骤：

4、(1)诱导前先将人类诱导性多能干细胞消化成单细胞悬浮液；

5、(2)第1-10天，将所述单细胞悬浮液使用神经诱导培养液培养，并添加10μmsb431542、100nm ldn193189、4μm xav939、1μm cyclopamine，诱导生成拟胚体；

6、(3)第11-12天，将所述拟胚体置于端脑分化培养液中培养，并添加15ng/ml bmp4和3μm chir99021，诱导生成端脑中背部；所述端脑分化培养液中包括b-27无维他命a的补充液；

7、(4)第13-30天，将端脑中背部置于海马原基分化培养液中培养，并添加20ng/mlwnt3a，其中第20-30天进一步添加1μm purmorphamine，诱导生成海马原基；所述海马原基分化培养液中包括纯b-27的补充液；

8、(5)第31天，将所述海马原基置于无血清神经培养基培养，并添加10ng/ml bdnf和10ng/ml gndf，诱导海马齿状回类器官成熟；

9、各步骤所述添加的时机为每次更换培养基时。

10、优选的，步骤(2)中，所述神经诱导培养液的组分包括：基础培养基dmem/f-12、血清替代补充液、非必需氨基酸溶液、谷氨酰胺补充液、巯基乙醇。

11、进一步优选的，步骤(2)中，所述神经诱导培养液的组分按质量分数计包括：15％血清替代补充液、1％非必需氨基酸溶液、1％谷氨酰胺补充液。

12、优选的，步骤(2)中，第1天还添加5％胎牛血清和50μm rock inhibitor，以及第2天添加10μm rock inhibitor。

13、优选的，步骤(3)中，所述端脑分化培养液的组分还包括：基础培养基dmem/f-12和neurobasal、n-2补充液、非必需氨基酸溶液、谷氨酰胺补充液、巯基乙醇。

14、进一步优选的，所述端脑分化培养液的组分按质量分数计包括：1％ b-27无维他命a的补充液、0.5％ n-2补充液、1％非必需氨基酸溶液、1％谷氨酰胺补充液。

15、进一步优选的，所述基础培养基dmem/f-12和neurobasal的添加比例为1:1。

16、优选的，步骤(4)中，所述海马原基分化培养液的组分还包括：基础培养基dmem/f-12和neurobasal、n-2补充液、非必需氨基酸溶液、谷氨酰胺补充液、巯基乙醇。

17、优选的，步骤(5)中，所述无血清神经培养基的组分包括：基础培养基neurobasal、纯b-27的补充液、n-2补充液、非必需氨基酸溶液、谷氨酰胺补充液、巯基乙醇。

18、进一步优选的，所述无血清神经培养基的组分按质量分数计包括：1％纯b-27的补充液、0.5％ n-2补充液、1％非必需氨基酸溶液、1％谷氨酰胺补充液。

19、优选的，步骤(2)中所述神经诱导培养液和步骤(4)中所述海马原基分化培养液每两天换一次。

20、优选的，步骤(5)中所述无血清神经培养基每周换2-3次。

21、本发明的第二方面提供一种海马齿状回类器官。

22、具体的，一种海马齿状回类器官通过分化海马齿状回类器官的诱导方法诱导分化而成。

23、本发明的第三方面提供一种海马齿状回类器官可应用于研究阿尔兹海默症病理。

24、本发明的第四方面提供一种海马齿状回类器官可应用于阿尔兹海默症药物筛选。

25、相对于现有技术，本发明的有益效果如下：

26、本发明通过调控海马齿状回类器官诱导方法中的关键调控因子及其使用的时间节点和浓度，本发明生成的海马齿状回类器官包含大量的海马祖细胞神经元和齿状回区颗粒神经元，细胞类型与人类发育中的海马体高度相关，并且本发明生成的海马齿状回类器官具有功能性的突触结构，具有信号传输功能的基本条件。