一种近红外二区荧光/光声双模态成像GSH探针及其制备方法和应用

本发明属于生物传感器，具体涉及一种近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针及其制备方法和应用。

背景技术：

1、谷胱甘肽(gsh)作为最重要的生物硫之一(生物硫包括gsh、同型半胱氨酸hcy和半胱氨酸cys等)，广泛分布于各种细胞、组织和器官中，在维持正常生命活动中的氧化还原平衡方面也起着重要作用。此外，据研究报道，细胞内gsh的过量表达与许多疾病尤其是癌症密切相关，因为癌症细胞会产生大量gsh来抵消其自身所产生的过量的活性氧物种(ros)。考虑到gsh可以作为一种重要的肿瘤生物标志物，因此发展一种活体内检测gsh的方法以此来实现肿瘤的可视化具有重要的意义。在过去的几十年里，荧光成像凭借其高时空分辨率、优异的灵敏度、实时检测和非侵入性的综合优势，已成为生物成像和生物传感领域的突出成像模式之一。到目前为止，已经许多种荧光探针被报道用于gsh的检测，然而这些探针激发和发射均位于可见光范围或第一个近红外窗口(nir-i，750～900nm)。尽管这些探针在细胞水平上的实现了gsh的检测，但该窗口中的探针的荧光信号很大程度上被生物分子自发荧光、强光散射和低光子穿透深度所限制，导致较差的信背比，因此使用这些探针在活体内检测gsh备受阻碍的。

2、与短波长特别是可见光范围相比，第二近红外成像窗口(nir-ii，900～1700nm)具有减少自发荧光、散射和更深光子穿透深度等显著的优点。光声(pa)成像是生物传感和生物成像领域的一种新的非侵入性和非离子性方法，它结合了纯光学组织成像中高选择性的边缘和纯超声组织3d成像中显著提高的穿透深度。

3、然而，到目前为止，大多数小分子pa探针的应用都受到了几种内源性生物分子(即血红蛋白、氧合血红蛋白、脂质和黑色素)的阻碍，因为其吸光度最大值在650至900nm之间，这可能会导致高背景。在nir-ii区域具有最大吸收的pa探针可以克服这个问题以获得更大的信背比和更深的组织穿透，从而产生高的检测灵敏度和成像对比度。

4、基于此，亟需开发一种近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种快速响应、高灵敏的近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针及其制备方法和应用，以解决生物背景荧光/光声信号高导致现有的荧光/光声探针无法有效用于生物体内gsh的高灵敏检测和高对比度成像的问题。

2、为了达到上述目的，本发明提供以下技术方案：

3、一种近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针(命名为mc-pse)，该gsh探针的结构式如下：

4、

5、所述gsh探针的反应机理如下：

6、

7、本发明还提供所述一种近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)将3-羟基-3-甲基-2-丁酮、丙二腈和乙醇钠加入过量的乙醇中进行搅拌，将混合物进行回流，然后依次进行冷却、减压过滤，得到黄色固体，洗涤后得到化合物1；

9、(2)惰性气体保护下，将dmf加入反应容器中，在设定温度下进行搅拌，将三氯氧磷缓慢加入到反应体系中，所得混合物在设定温度下进行反应，然后将环己酮缓慢加入到反应体系中，升温至预定温度，继续进行反应；反应停止后，将反应液快速冷却，充分搅拌，冷却后析出大量黄色固体后，减压过滤得到滤饼，洗涤后得到化合物2；

10、(3)将步骤(1)所得化合物1、步骤(2)所得化合物2溶于醋酸酐中，然后加入醋酸钠，在预定温度下进行搅拌，将反应液滴入乙醚/石油醚中，析出黑色固体，纯化处理，得到化合物3；

11、(4)惰性气体保护下，将1,2-二苯基硒醚、nabh4置于反应器中，在设定温度下进行冷却，加入乙醇，在预定温度下进行反应，得到反应体系；将步骤(3)所得化合物3溶于甲醇中，得到含化合物3的溶液，将所述含化合物3的溶液加入到反应体系中，在室温下继续反应，去除溶剂后，纯化粗产物，得到呈深绿色粉末，即所述近红外二区荧光/光声双模态成像gsh探针(mc-pse)；

12、其反应式为：

13、

14、优选的，步骤(1)中，3-羟基-3-甲基-2-丁酮、丙二腈和乙醇钠的物质的量之比为1：(2～3)：(3～5)。

15、优选的，步骤(1)中，将滤液进行减压蒸馏，过滤，低温环境下用乙醇洗涤，除去杂质，得到另外的化合物1。

16、优选的，步骤(2)中，三氯氧磷、dmf和环己酮的体积之比为1：(2～2.5)：(0.8～1)。

17、优选的，步骤(3)中，化合物1、化合物2和醋酸钠的物质的量之比为1：(0.45～0.6)：(3～5)。

18、优选的，步骤(4)中，1,2-二苯基硒醚、nabh4和化合物3的物质的量之比为1：(1.5～2)：(0.8～1)。

19、本发明还提供一种gsh反应激活解组装的纳米荧光探针，该纳米荧光探针由所述的gsh探针(mc-pse)、dpbs缓冲溶液中自组装制成，其示意图如下：

20、

21、本发明还提供所述一种gsh反应激活解组装的纳米荧光探针的合成方法，包括：

22、将gsh探针溶于有机溶剂中，然后加入到dpbs缓冲溶液中，形成j-聚集体，即得。

23、优选的方案，gsh探针的浓度为10～20μm，甲基亚砜体积比例为1～30％，测试效果较好。

24、更优选的方案，gsh探针的浓度为10μm，甲基亚砜体积比例为30％，可得到最佳测试效果。

25、本发明还提供所述gsh探针、纳米荧光探针的应用，将其作为荧光/光声探针应用于检测体外缓冲溶液中和活体肿瘤内的gsh。

26、本发明提出了自组装-解组装识别gsh的策略，设计了一种近红外二区荧光/光声双模态探针mc-pse，探针与gsh反应后，释放出荧光团，产生很强的近红外二区荧光信号和“比率型”光声信号。探针在水溶液中能够自组装形成纳米j聚集体，进一步猝灭探针的荧光，从而使得探针具有极低的背景荧光信号；同时gsh与探针反应后，反应产物具有很好的水溶性，j聚集体解组装，吸收光谱显著蓝移，表现为“比率型”光声信号和显著增强的荧光信号。因此，探针实现活体肿瘤内gsh的高灵敏检测和近红外二区荧光/光声双模态成像。本发明能够很好地克服生物背景荧光/光声信号的干扰，有望提高活体成像分析gsh的准确性和灵敏度。

27、本发明提出了“自组装—识别—解组装”策略，构建了一种近红外二区荧光/光声双模态成像探针(mc-pse)，探针在检测体系中可自组装形成纳米j-聚集体，与gsh反应后诱导j-聚集体解组装，近红外二区荧光信号显著增强，同时释放出“比率型”光声信号。

28、与现有技术相比，具有的有益技术效果为：

29、1)所述gsh探针(mc-pse)能够快速响应gsh(15min左右响应饱和)，灵敏度高(检测限0.4μm)；

30、2)所述gsh探针吸收和发射位于近红外二区，能够有效克服生物背景信号干扰；

31、3)所述gsh探针能自组装形成j聚集体，gsh响应诱导j聚集体解组装；

32、4)所述gsh探针实现了小鼠肿瘤的近红外二区荧光/光声双模态成像，体现了本发明成像介导肿瘤手术的临床应用前景。