PvPSK3基因在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用

本发明属于生物。更具体地，涉及一种pvpsk3基因(pavir.3kg025900)在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用。

背景技术：

1、柳枝稷(panicumvirgatum)、高粱(sorghumbicolor)和玉米(zeamays)等作物是重要的能饲草、粮食作物和模式植物，在绿色能源、畜牧业发展、粮食安全和植物基础研究中具有重要价值。在禾本科植物的遗传改良研究中，遗传转化是一种必不可少的手段，在基因组编辑、性状精准改良、植物分子设计育种、基因功能研究等过程发挥着重要作用。柳枝稷、高粱和玉米的遗传转化技术日益成熟，但仍然存在基因型限制严重、转化效率偏低等问题，导致目前仅有少数品种/基因型遗传转化体系被成功建立。

2、phytosulfokine(psk)是一种磺化五肽生长因子，普遍存在于单子叶植物和双子叶植物中，对促进植物细胞的增殖和分化具有重要作用。然而，过去通过培养基中外源施加psk以调节细胞增殖和分化，但外源施加对内源响应有影响作用，导致psk对不同品种/基因型的不同组织作用效果不同，不具有普适性，重复性差，且目前该化合物市场已无法获得。至今未见该基因作为辅助转化分子工具在植物组培快繁与遗传转化方面的使用，因此本专利构建新的可同时促进愈伤形成与再生的遗传转化辅助分子工具，用于柳枝稷、高粱和玉米等禾本科植物基因组编辑与遗传改良，大幅度提高禾本科植物的遗传转化效率，促进转基因育种技术和分子精准设计育种技术的发展，推动高产、优质、抗逆性强的新品种培育进程。

技术实现思路

1、针对提高禾本科植物遗传转化效率的目标，本发明提供了pvpsk3基因在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用，所述柳枝稷pvpsk3基因能够提高其阳性愈伤获得率、愈伤组织再生效率和缩短愈伤分化成绿芽的时间，来提高其遗传转化效率。

2、本发明是通过如下技术方案来实现的：

3、本发明的第一方面提供pvpsk3基因在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用，所述pvpsk3基因能够提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间，所述pvpsk3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的第二方面提供pvpsk3基因的重组表达载体、基因工程菌、转基因细胞系或pvpsk3基因编码的蛋白在如下1)或2)中的应用：

5、1)提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短阳性愈伤分化形成绿芽时间；

6、2)培育阳性愈伤组织获得率提高或愈伤组织再生效率提高或缩短愈伤分化形成绿芽时间的柳枝稷、高粱和玉米等禾本科植物品种。

7、本发明的第三方面提供一种提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率或再生效率或缩短愈伤分化形成绿芽时间的方法，包括用如下a)-d)任一项所述的核苷酸序列转化植物并使所述核苷酸序列在所述植物中表达的步骤；

8、a)seq id no.1所示的dna片段；

9、b)编码seq id no.2所示氨基酸序列的dna片段；

10、c)与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seq id no.2所示的蛋白等价的dna片段；

11、d)cdna片段或dna片段，其在严格条件下与a)或b)的dna片段杂交，且编码seq idno.2所示的蛋白。

12、本发明的第四方面提供一种培育阳性愈伤组织获得率提高或愈伤再生率提高或缩短愈伤分化形成绿芽时间的转基因柳枝稷、高粱或玉米的方法，是将如下a)-d)任一项所述的核苷酸序列导入柳枝稷、高粱或玉米得到遗传转化效率提高的转基因植物；

13、a)seq id no.1所示的dna片段；

14、b)编码seq id no.2所示氨基酸序列的dna片段；

15、c)与a)或b)限定的dna片段具有75％或75％以上同一性，且编码的蛋白在功能上与seq id no.2所示的蛋白等价的dna片段；

16、d)cdna片段或dna片段，其在严格条件下与a)或b)的dna片段杂交，且编码seq idno.2所示的蛋白。

17、上述方法中，将所述的核苷酸序列导入柳枝稷、高粱和玉米的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

18、上述方法中，所述柳枝稷、高粱和玉米的遗传转化效率提高是如下1)-5)中的至少一种：

19、1)在转化过程中，所述侵染的柳枝稷愈伤组织中，阳性细胞增殖速度提高，进而提高阳性愈伤组织的获得效率；

20、2)在转化过程中，所述侵染的高粱或玉米的幼胚，胚性愈伤组织形成效率提高，进而提高阳性愈伤组织获得效率；

21、3)在转化过程中，所述转基因的柳枝稷、高粱和玉米的阳性愈伤组织再生诱导过程中，愈伤分化形成绿芽的时间早于对照组愈伤；

22、4)在转化过程中，所述转基因的柳枝稷、高粱和玉米的阳性愈伤组织再生诱导过程中，愈伤再生效率高于对照组愈伤。

23、本发明与现有技术相比的有益效果：本发明从柳枝稷中克隆得到一个新型pvpsk3基因，并首次在禾本科植物中研究此基因提高遗传转化效率的功能，利用包含所述基因的cds全长片段的dna序列构建过表达载体，然后导入农杆菌，并用农杆菌介导法转化柳枝稷愈伤的过程中发现，与转化panic6b空载体对照相比，过表达pvpsk3能够促进阳性愈伤组织获得效率，且阳性愈伤组织分化显著提前，分化出更多的绿芽，提高再生效率。同时，利用农杆菌介导法将pvpsk3过表达载体转化高粱和玉米幼胚，能够促进其幼胚向胚性愈伤组织形成，进而提高阳性愈伤组织的获得效率，且提高阳性愈伤组织的再生效率和缩短阳性愈伤分化形成绿芽的时间。因此，过量表达该基因并应用于遗传转化困难的禾本科骨干种质，有助于提高其遗传转化效率，进而提高禾本科骨干种质的产量、品质和抗逆性，具有重要的经济价值和社会效益。

技术特征：

1.pvpsk3基因在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用，其特征在于，pvpsk3基因能够提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间，所述pvpsk3基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

2.一种含有pvpsk3基因的重组表达载体在如下1)或2)中的应用：其特征在于，所述的1)为提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间；

3.一种含有pvpsk3基因的基因工程菌在如下1)或2)中的应用，其特征在于，所述的1)为提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间；

4.一种含有pvpsk3基因的转基因细胞系在如下1)或2)中的应用，其特征在于，所述的1)为提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间；

5.一种pvpsk3基因编码的蛋白在如下1)或2)中的应用，其特征在于，所述的1)为提高柳枝稷、高粱和玉米阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间；

6.根据权利要求2-5任何一项所述的应用，其特征在于，所述方法包括用如下a)-d)任一项所述的核苷酸序列转化植物并使所述核苷酸序列在所述植物中表达的步骤；

7.根据权利要求2-5任何一项所述的应用，其特征在于，是将如下a)-d)任一项所述的核苷酸序列导入柳枝稷、高粱或玉米得到遗传转化效率提高的转基因植物；

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，将所述的核苷酸序列导入柳枝稷、高粱和玉米的方法包括：聚乙二醇法、农杆菌介导法或基因枪轰击法。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在所述方法中，所述柳枝稷、高粱和玉米的遗传转化效率提高是如下1)-4)中的至少一种：

技术总结
本发明涉及PvPSK3基因及其在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用，属于生物技术领域，所述应用包括含有PvPSK3基因的重组载体、表达盒或重组菌在提高禾本科植物遗传转化效率中的应用。本发明从柳枝稷中克隆得到一个PvPSK3基因，并将其通过植物表达载体以基因工程手段整合到禾本科植物染色体上，首次发现PvPSK3基因能显著提高禾本科植物的遗传转化效率。经过对该基因的研究发现，该基因过表达可以提高柳枝稷、高粱和玉米转化后的愈伤或幼胚阳性愈伤组织获得率和再生效率，且缩短愈伤分化形成绿芽时间，且对转基因植物后续生长发育没有不利影响。

技术研发人员：付春祥,刘敏,王玉,姜珊珊
受保护的技术使用者：中国科学院青岛生物能源与过程研究所
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15