高产乙酰化内酯型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌及其构建方法与流程

本发明涉及一株高产乙酰化内酯型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌及其构建方法。

背景技术：

1、槐糖脂是由酵母类微生物发酵获得的一种生物表面活性剂，相较于化学表面活性剂具有很好的温和性、生物相容性以及较低的化学毒性。根据市场供求数据以及实验室相关研究论文显示，目前能够大量合成槐糖脂并产生经济效益的菌种很少，而其中能大量合成乙酰化内酯型槐糖脂并能够工业化的菌种目前没有。

2、据研究报道，二乙酰化内酯型槐糖脂对海拉细胞系有强抑制能力。同时根据国内的研究性学术文献显示，二乙酰化内酯型槐糖脂还对肝癌细胞、肺癌细胞、食管癌细胞、胃癌细胞以及直肠癌细胞均有较好的抑制能力。相较于现在普遍采用的手术治疗手段和化疗靶向治疗手段。在抑制癌细胞的同时，对机体正常细胞影响较小。因此高产乙酰化内酯型槐糖脂假丝酵母转基因工程菌(candida sp.dgsl-200)的发酵产物具有非常好的抗癌药物提取、提纯加工的开发潜力。

技术实现思路

1、本发明提供一株高产乙酰化内酯型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌及其构建方法，其能工厂化规模的合成具有生物活性的二乙酰化内酯型槐糖脂为主要产物的槐糖脂。

2、与现有技术相比，本发明采用的技术方案为：高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌，其特征在于：所述的熊蜂生假丝酵母菌(candidasp.dgsl-200)于2022年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m 2022936。

3、高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌的构建方法，对由产槐糖脂熊蜂生假丝酵母菌指导合成内酯化酶的mrna逆转录为cdna，克隆出内酯化酶的dna链基因lipase one经修饰改造后，与ppic9k表达载体连接，导入熊蜂生假丝酵母(candidabombicola)构建成能超量表达乙酰化内酯酶的高产乙酰化内酯型槐糖脂假丝酵母转基因工程菌(candida sp.dgsl-200)。

4、具体方法步骤为：

5、步骤一：从熊蜂生假丝酵母(candida bombicola)菌体胞浆中分离出能指导合成内酯化酶的mrna链经逆转录成cdna链克隆出内酯化酶基因序列dglip1；

6、步骤二：将内酯化酶基因dglip1进行修饰改造与含有强启动子pccw12和终止子thsp26的酵母整合型质粒yiplac211进行链接，构成yip-dglip1克隆载体；

7、步骤三：将步骤二得到的yip-dglip1克隆载体与表达载体ppic9k载体连接，构建出表达质粒ppic9k-yip-dglip1；

8、步骤四：将步骤三构建的表达质粒ppic9k-yip-dglip1酶切线性化后，导入产槐糖脂熊蜂生假丝酵母菌(dgsl-100)中；

9、步骤五：测定表达质粒ppic9k-yip-dglip1转化进入熊蜂生假丝酵母(candidabombicola)菌体中，从而得到高产乙酰化内酯型槐糖脂假丝酵母转基因工程菌(candidasp.dgsl-200)。

10、与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果：

11、1、本发明高产乙酰化内酯型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌含有较高的二乙酰化内酯型槐糖脂。

12、2、本发明同等原料、人工、电费、时间投入，该工程菌相较于其它能够工厂化生产槐糖脂的菌种单次发酵可以获得更多的含高比例乙酰化内酯型槐糖脂的混合型槐糖脂，从而减少能源消耗、降低对环境的污染以及经济效益的提升。

13、3、本发明单次发酵获得的含高比例乙酰化内酯型槐糖脂的混合型槐糖脂由于乙酰化内酯型槐糖脂比例高，具有自然结晶的特性，便于分离提取加工。

14、4、本发明乙酰化内酯型槐糖脂是通过微生物发酵途径获得的产物，相较于化学表面活性剂具有更好的亲肤性和更低的细胞毒性，可以进一步分离提纯获得化妆品级的无乙酰化内酯型槐糖脂和一乙酰化内酯型槐糖脂，起到良好乳化性能以及一定的抑菌防腐能力。

15、5、本发明由于二乙酰化内酯型槐糖脂具有较低的细胞毒性和刺激性，而且具有良好的生物相容性，二乙酰化内酯型槐糖脂提纯品经过除杂和去热源后可以用作医药原料，具有抗癌药物的开发和替代高毒性的高分子化学抗癌药以及昂贵的靶向抗癌药的潜力。

技术特征：

1.高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌，其特征在于：所述的熊蜂生假丝酵母菌（candida sp.dgsl-200）于2022 年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：cctcc no:m 2022936。

2.根据权利要求1所述的高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌的构建方法，其特征在于：对由产槐糖脂熊蜂生假丝酵母菌指导合成内酯化酶的mrna逆转录为cdna，克隆出内酯化酶的dna链基因lipase one经修饰改造后，与ppic9k表达载体连接，导入熊蜂生假丝酵母(candida bombicola)构建成能超量表达乙酰化内酯酶的高产乙酰化内酯型槐糖脂假丝酵母转基因工程菌（candida sp.dgsl-200）。

3.根据权利要求2所述的高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌的构建方法，其特征在于：具体方法步骤为：

技术总结
本发明涉及一株高产乙酰化内酯型槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌及其构建方法。其能工厂化规模的合成具有生物活性的二乙酰化内酯型槐糖脂为主要产物的槐糖脂。高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌（Candida sp.DGSL‑200）于2022年06月20日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC NO:M 2022936，高产乙酰化内酯型产槐糖脂的熊蜂生假丝酵母菌的构建方法为对由产槐糖脂熊蜂生假丝酵母菌指导合成内酯化酶的mRNA逆转录为cDNA，克隆出内酯化酶的DNA链基因Lipase one经修饰改造后，与pPIC9K表达载体连接，导入熊蜂生假丝酵母(Candida bombicola)构建成能超量表达乙酰化内酯酶的高产乙酰化内酯型槐糖脂假丝酵母转基因工程菌（Candida sp.DGSL‑200）。

技术研发人员：魏战胜,徐广启,魏凯,魏浩然
受保护的技术使用者：陕西德冠生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16