一种热稳定性提升的蛋白酶K突变体及其应用

本发明涉及基因工程和遗传工程，涉及一种热稳定性提升的蛋白酶k(prok)突变体及其应用。

背景技术：

1、蛋白酶是水解蛋白质肽链的一类酶的总称。按其降解多肽的方式分成内肽酶和端肽酶两类。按其活性中心和最适ph值，又可将蛋白酶分为丝氨酸蛋白酶、巯基蛋白酶、金属蛋白酶和天冬氨酸蛋白酶。按其反应的最适ph值，分为酸性蛋白酶、中性蛋白酶和碱性蛋白酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。碱性蛋白酶属于内肽酶中的丝氨酸蛋白水解酶类，可以在碱性环境(最适ph一般在9.0-11.0之间)水解蛋白质中的肽键。碱性蛋白酶主要应用于加酶洗涤剂工业，在制革、丝绸、饲料、医药、食品、环保等工业也有广泛的应用。

2、蛋白酶k是一种来自于nanococcus limber albus的碱性丝氨酸蛋白酶。蛋白酶k具有极高的酶活性和广泛的底物特异性，能优先分解与疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸c末端邻接的酯键和肽键，在工业生产、废弃物处理以及医药领域得到了广泛的应用。brilhante等人发现，蛋白酶k对皮肤癣菌的生物膜具有活性，可通过与特比萘芬和灰黄霉素的相互作用提高药物对成熟皮肤癣菌生物膜的效果。而在蛋白质降解工业生产中，蛋白酶k能够高效地将生物质中的蛋白质水解，从固体有机物中得到氨基酸和寡肽，提高如蚕蛹等有机产品的经济价值，减少有机废弃物对环境的污染。程尚等人利用蛋白酶k降解蜂王浆，生产富钙型的水溶性蜂王浆产品，取得了比较好的效果。

3、针对现代食品产业对性能优异的高活性高稳定性蛋白酶的需求，获得具有优良特性的蛋白酶k突变体仍具有重大意义。

技术实现思路

1、解决的技术问题：本发明提供一种热稳定性提升的蛋白酶k突变体及其应用。

2、技术方案：一种碱性丝氨酸蛋白酶突变体，以来自于林伯氏白色念球菌(nanococcus limber albus)的碱性丝氨酸蛋白酶野生型prok的序列为基础，所述碱性丝氨酸蛋白酶野生型prok的氨基酸序列如seq id no.2所示，其核酸序列如seq id no.1所示，其中第206位苏氨酸为突变位点，突变为甲硫氨酸。

3、上述突变体记为蛋白酶突变体prok-t206m，氨基酸序列如seq id no.4所示。

4、编码所述突变体的核酸，核苷酸序列如seq id no.3所示。

5、一种重组载体，含有上述核苷酸序列。

6、一种重组菌株，含有上述重组载体。

7、上述重组菌株在降解蛋白质生产中的应用

8、有益效果：本发明提供一种性质优良的、适合于工业生产条件下催化蛋白质降解的碱性丝氨酸蛋白酶蛋白酶k突变体。该突变体最适ph在8-10之间，在ph1-12之间，突变体prok-t206m的稳定性均优于野生型。在最适温度适应性方面，野生型蛋白酶k的最适温度为60℃而prok-t206m的最适温度为65℃。而在65，70和75℃下的相对酶活，prok-t206m比野生型分别提高10％、27％和15％。通过测定prok-t206m的动力学常数，prok-t206m的km较prok野生型有所降低而vmax则有所提升，证明了prok-t206m的底物亲和力和催化活性高于prok野生型。在热稳定性方面，prok-t206m在65℃下的半衰期分别较prok野生型延长30min。prok-t206m在最适温度的提高有利于该酶在工业化蛋白质降解中更好的发挥降解功能；且prok-t206m的热稳定性比野生型酶有一定的提高，这样的性质能够使得酶能够更好的抵抗高温降解条件下导致的酶失活。这样一种在工业生产条件下催化活力高、热稳定性优良的碱性丝氨酸蛋白酶，在工业生产、废弃物处理以及医药生产等领域中具有极大的应用潜力。

技术特征：

1.一种热稳定性提升的蛋白酶k突变体，其特征在于，以来自于林伯氏白色念球菌（nanococcus limber albus）的碱性丝氨酸蛋白酶野生型prok的序列为基础，所述碱性丝氨酸蛋白酶野生型prok的氨基酸序列如seq id no.2所示，其中第206位苏氨酸为突变位点，突变为甲硫氨酸。

2.根据权利要求1所述热稳定性提升的蛋白酶k突变体，其特征在于，所述突变体记为蛋白酶突变体prok-t206m，氨基酸序列如seq id no.4所示。

3.编码权利要求2所述突变体的核酸，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.一种重组载体，含有权利要求3所示的核苷酸序列。

5.一种重组菌株，含有权利要求4所述的重组载体。

6.权利要求5所述重组菌株在降解蛋白质生产中的应用。

技术总结
一种热稳定性提升的蛋白酶K突变体及其应用，以来自于林伯氏白色念球菌（Nanococcus limber albus）的碱性丝氨酸蛋白酶野生型Prok的序列为基础，所述碱性丝氨酸蛋白酶野生型Prok的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，其中第206位苏氨酸为突变位点，突变为甲硫氨酸。本发明提供一种性质优良的、适合于工业生产条件下催化蛋白质降解的碱性丝氨酸蛋白酶蛋白酶K突变体。该突变体最适pH在8‑10之间，在pH1‑12之间，突变体Prok‑T206M的稳定性均优于野生型。

技术研发人员：游帅,朱璇,王俊,何晓晓,卢宇,张颖,赵卫国
受保护的技术使用者：江苏科技大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16