一种同时检测多种术后感染病原体的多重RT-PCR探针组及其试剂盒和应用的制作方法

本发明属于生物检测，具体公开了一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr探针组及其试剂盒和应用。

背景技术：

1、呼吸道感染分为上呼吸道感染和下呼吸道感染，前者是鼻腔、咽或喉部急性炎症的总称，后者包括急性气管—支气管炎、慢性支气管炎、肺炎、支气管扩张等。本类疾病发病率高，人群普遍易感，特别是儿童、老人、营养不良及患有慢性病者更易患病，以冬春季发病较多。呼吸道感染病原学复杂，包括细菌、病毒、支原体、衣原体、真菌等，其中80％以上是病毒性的，各年龄段患者病原类型分布可能不同。该病不分季节、任何年龄均可发病，通过含有病原体的飞沫、雾滴，或经污染的器具进行传播。患者常由于机体抵抗力降低时，如受寒、劳累、淋雨等情况，原已存在或由外界侵入的病原体迅速生长繁殖，导致感染。手术后病人免疫力下降，呼吸道感染风险增加，在住院患者中，肺炎链球菌、肺炎支原体和肺炎衣原体更常见，而铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌和gas在门诊患者中更常见。感染可导致多种严重并发症，包括肺炎、脑膜炎、急性心肌炎、中耳炎、急性肾炎等，还可诱发慢性疾病急性加重，严重威胁患者的生命健康。现阶段我国市面上缺乏同时检测细菌+病毒的检测手段，临床常用的抗原检测种类少，灵敏度不高，且需要专业技术人员的支持。而病原培养耗时较长，一般需要3-5天，给临床上的诊断与治疗带来不便。mngs检测灵敏快捷，一天便可得到结果，但测序费用高昂，加之目前未获批，只能以医学实验的形式送至相关公司检测，无法大规模应用。呼吸道病原体多联检测成本较低，且可以大大缩短检测时间，扩大检测范围，提高临床用药的针对性和及时性，对临床工作而言有重要意义。

2、虽然多重pcr技术虽然目前已经较为成熟，但是在临床使用中仍有部分局限性：当多对引物同时扩增时，若试验设计和靶向序列选择不当，则容易交叉干扰，导致扩增失败、特异性降低等问题。因此，在实验设计时不能简单地增加引物种类，需要选择合适的引物并设计实验流程。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明公开了一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr探针组及其试剂盒和应用。

2、本发明包括以下技术方案：

3、一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr探针组，包括以下探针：

4、肺炎链球菌的检测探针,其核苷酸序列如seq id no.3所示；

5、甲型流感病毒的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.6所示；

6、乙型流感病毒的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.9所示

7、人冠状病毒的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.12所示；

8、铜绿假单胞菌的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.15；

9、人呼吸道合胞病毒的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.18所示；

10、金黄色葡萄球菌的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.21所示。

11、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr探针组，

12、所述肺炎链球菌的检测探针序列5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

13、所述甲型流感病毒的检测探针序列5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；

14、所述乙型流感病毒的检测探针序列5’端标记有vic发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

15、所述人冠状病毒的检测探针序列5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

16、所述铜绿假单胞菌的检测探针序列5’端标记有rox发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2；

17、所述人呼吸道合胞病毒的检测探针序列5’端标记有vic发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1；

18、所述金黄色葡萄球菌的检测探针序列5’端标记有fam发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq1。

19、本发明还公开了一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，包括上述的探针组。

20、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，还包括以下引物对：

21、肺炎链球菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

22、甲型流感病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

23、乙型流感病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

24、人冠状病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

25、铜绿假单胞菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

26、人呼吸道合胞病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物；

27、金黄色葡萄球菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物。

28、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，

29、所述肺炎链球菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq idno.1-2所示；

30、所述甲型流感病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq idno.4-5所示；

31、所述乙型流感病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq idno.7-8所示；

32、所述人冠状病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq idno.10-11所示；

33、所述铜绿假单胞菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq idno.13-14所示；

34、所述人呼吸道合胞病毒的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seq id no.16-17所示；

35、所述金黄色葡萄球菌的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物的核苷酸序列如seqid no.19-20所示。

36、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，还包括：

37、人dna内参的检测探针，其核苷酸序列如seq id no.24所示；所述人dna内参的检测探针序列5’端标记有cy5发光基团，3’端标记有荧光淬灭基团bhq2。

38、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，还包括：

39、人dna内参的正向pcr扩增引物、反向pcr扩增引物，其核苷酸序列如seq idno.22-23所示。

40、进一步的，上述一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr的试剂盒，还包括pcr引物探针缓冲液和taq酶；

41、所述pcr引物探针缓冲液中保存有检测探针和引物；

42、所述pcr引物探针缓冲液还包括以下成分：150mm tris-hcl，30mm kcl，10mmmgcl2，35mm硫酸铵，400μm dntp，2mm dtt，3％ dmso，0.02％吐温20，余量为无核酸酶水。

43、优选的，一般的qpcr每个反应管中最多检测4种波段的荧光信号，因此考虑到实际情况，我们可以将多种病原体的扩增引物和检测探针分为3管，分别检测2、2、3种病原体，并添加内参基因，以保证每个反应管中最多检测4种标靶。所述pcr引物探针包括管1试剂、管2试剂、管3试剂中的任意一种或多种，所述管1试剂、管2试剂、管3试剂均包括pcr引物/探针缓冲液、病原体扩增引物和检测探针、人dna内参引物和检测探针中的任意一种或多种。

44、进一步优选的，所述管1试剂包括肺炎链球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒的扩增引物和检测探针的任意一种或多种，所述管2试剂包括人冠状病毒、铜绿假单胞菌的扩增引物和检测探针中的任意一种或多种，所述管3试剂包括人呼吸道合胞病毒、金黄色葡萄球菌的扩增引物和检测探针中的任意一种或多种。

45、本发明还公开了上述探针组或试剂盒在制备术后病原体检测试剂盒中的应用，包括以下步骤：

46、步骤(1)：

47、将样品提取模板、无rnase水、阳性质控品各7μl分别加入不同的pcr反应管中，并向各管中加入pcr引物探针缓冲液22μl、hot start taq酶1μl和配成体系，盖好管盖，放入荧光定量pcr仪中进行荧光pcr检测；

48、步骤(2)；

49、设置仪器中的pcr扩增反应条件：50℃2分钟-3.1℃/s；95℃2秒钟-3.1℃/s；95℃1秒钟-3.1℃/s，60℃10秒钟-2.38℃/s并采集荧光，循环40次；

50、步骤(3)：

51、步骤(2)反应完成后，基线设定为自动调整，根据扩增曲线图和ct值对检测结果进行分析；

52、步骤(4)：有效性判定：

53、无rnase水检测出的ct值为undet或40，且阳性质控品检测出的ct值≤38，否则实验视为无效；

54、步骤(5)：结果判读：

55、样本检测孔ct值为undet或40，该样本结果判断为阴性，样本dna/rna提取失败、待测样本中不含dna/rna或含量低于检测限；

56、样本检测孔ct值≤38，该样本结果判断为对应的病原体阳性，样本检测成功；

57、样本检测孔ct值为38-40，需要复检一次，如果ct值仍为38-40，则判断为阴性；

58、进一步的，上述探针组或试剂盒在制备术后病原体检测试剂盒中的应用，所述样品选自咽拭子样本和痰液样本中的一种或者两种。

59、本发明具有以下有益效果：

60、本发明公开了一种同时检测多种术后感染病原体的多重rt-pcr探针组及其试剂盒和应用，能同时针对多种术后感染病原体肺炎链球菌、甲型流感病毒、乙型流感病毒、人冠状病毒、铜绿假单胞菌、人呼吸道合胞病毒和金黄色葡萄球菌进行检测；本试剂盒针对所检测的多种呼吸道病原体设计引物及试验方案，能够降低交叉干扰，拥有较好的特异性和较高的特异性，并缩短检测时间，提高检测效率；本试剂盒能够针对术后感染的病患进行呼吸道病原菌的筛查检测，对术后感染性疾病进行针对性治疗有重要作用，将为医院及其它医疗机构提供一种灵敏、准确、快速且低成本的检测方案。