一种寡聚DNA抑制非特异性扩增的方法

本发明涉及一种寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，尤其涉及一种带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，属于核酸扩增领域。

背景技术：

1、聚合酶链反应(pcr)是一种分子诊断技术，已广泛用于生物学领域(foodmeasure,2018,12,675-682；clinical microbiology reviews,2020,33,48；curr.fungal.infect.rep.,2019,13,260-273)。在pcr扩增过程中，尤其是在高背景dna条件下的核酸扩增，引物和非目的片段之间不可避免的会出现一些互补配对，极易导致非特异性扩增产物的产生。这些非特异性扩增严重影响核酸检测的灵敏度和特异性，因此，如何抑制非特性扩增的问题亟待解决。

2、近年来，研究者们采用热启动酶、聚合酶抗体修饰等方法来抑制非特异性扩增，防止样品制备过程中生成非特异性扩增，然而这些方法难以抑制pcr循环过程中产生的非特异性扩增；另外，有研究者采用touch down、提高退火温度(molecules,2015,20,6048-6059；nucleic acids research,2005,33,e180-e180)等方法来抑制非特异性扩增。但是当引物浓度高时，这些方法仍难以有效抑制其生成；此外，brownie等人开发了一种hand(nucleic acids research,1997,25,3235-3241)系统抑制引物二聚体的方法，然而此方法需根据模板针对性的设计引物序列，过程繁琐；而使用jong-yoon chun等人开发的dpo(nucleic acids research,2007,35,e40-e40)技术抑制非特异扩增时，却未能起到较好的抑制效果；一些碱基修饰方法(biology methods and protocols,2020,5,bpaa004；biotechniques,2009,47,881-882)也被用于抑制非特异性扩增，但是这些方法涉及修饰，价格昂贵。

3、综上，亟需开发一种高效、序列设计简单、普适性好的抑制非特异性扩增方法。

技术实现思路

1、针对现有技术中存在“非特异性扩增严重影响核酸扩增的灵敏度和特异性，且现有的抑制方法存在难以高效抑制、序列设计繁琐等”的问题，依据pcr反应动力学，本申请提出一种寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，在pcr反应体系中加入寡聚dna。dna聚合酶结合寡聚dna的能力高于引物与非目标片段或一对引物结合dna聚合酶的能力，因此能够有效抑制非特异性扩增，而不影响特异性扩增。

2、为解决上述技术问题，本发明采取的技术方案是，一种寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，

3、在核酸扩增中，加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna，所述寡聚dna为带有5’-凸出端和短茎环的结构；值得注意的是，5’端凸出长度为5nt-7nt，此时dna聚合酶与该结构处于动态结合的状态，使得该结构难被聚合酶延伸。

4、所述核酸扩增为恒温扩增、pcr反应体系扩增中的一种。

5、pcr反应程序分为扩增阶段和熔解阶段。扩增阶段：95℃预变性3min；循环周期为95℃变性15s；58℃退火20s；72℃延伸20s(此步骤设置荧光采集)，一般持续30-50个循环。熔解阶段：从60℃开始以0.2℃/s升温至95℃，同时采集荧光信号。

6、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna适用于各种核酸扩增方法，更适用于抑制高背景dna存在条件下pcr反应体系中的非特异性扩增的生成。

7、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的茎部长度为6bp-12bp，环部长度为3nt-10nt，5’-凸出端长度为3nt-10nt的寡聚dna。上述的带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna能体现较好的抑制非特异性扩增的作用，强于仅含平末端茎环结构的寡聚dna。

8、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna为茎部长度为8bp-10bp、环部长度为3nt-6nt、5’-凸出端长度为5nt-7nt的寡聚dna。

9、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的浓度为10nm-500nm。低浓度的寡聚dna即可实现对于非特异性扩增的抑制。寡聚dna浓度越高，抑制非特异性扩增的效果越好。

10、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，为防止寡聚dna对特异性扩增造成影响，加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的浓度为50nm-200nm。

11、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，在高背景dna存在条件下的pcr反应体系中，对抑制引物与非目标片段结合产生的非特异性扩增时，和/或抑制引物二聚体时,加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna。

12、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的茎部长度为8bp-10bp、环部长度为3nt-6nt、5’-凸出端长度为5nt-7nt时，在55℃-72℃退火温度下，对于非特异性扩增的抑制。

13、优化的，上述寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，在核酸扩增中，加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna，针对低模板浓度、高背景dna浓度条件下非特异性扩增进行抑制。

14、本申请的有益效果为：

15、本申请的技术方案中，采用“寡聚dna抑制非特异性扩增的方法”，依据pcr反应动力学，dna聚合酶与引物、模板引物复合物、非目的片段引物复合物之间的结合存在平衡，dna聚合酶倾向于结合到碱基完全互补配对的dna双链上。当有寡聚dna存在时，模板—引物复合物之间碱基互补数大致为20bp，而寡聚dna自身的3’端仅存在6bp-12bp互补，引物与非目的片段之间的碱基连续互补数一般小于6bp，所以，dna聚合酶结合寡聚dna的能力高于引物与非目标片段或一对引物结合dna聚合酶的能力，但不影响靶标特异性扩增从而有效抑制非特异性扩增。

16、本申请设计的寡聚dna适用于所有pcr反应体系，不需根据模板序列进行特异性的设计。

17、本申请仅需10nm-500nm寡聚dna即可实现对非特异性扩增的高效抑制，其效率较高。

18、相比于聚合酶抗体修饰、碱基修饰等方法，本申请的技术方案不需要进行修饰，大大降低了成本。

19、本申请设计的寡聚dna可以抑制引物二聚体产生的非特异性扩增，尤其可抑制高背景dna条件下由引物与非目标片段产生的非特异性扩增。

20、本申请中，利用寡聚dna仍可实现采用染料法进行核酸检测，不必使用taqman探针法，节省检测成本。

技术特征：

1.一种寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：非特异性扩增为背景dna存在条件下产生的；所述寡聚dna为带有5’-凸出端和短茎环的结构。

2.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的茎部长度为6bp-12bp，环部长度为3nt-10nt，5’-凸出端长度为3nt-10nt的寡聚dna。

3.根据权利要求2所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna为茎部长度为8bp-10bp、环部长度为3nt-6nt、5’-凸出端长度为5nt-7nt的寡聚dna。

4.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的浓度为10nm-500nm。

5.根据权利要求4所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的浓度为50nm-200nm。

6.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：在pcr反应体系中，对抑制背景dna存在条件下由引物与非目标片段产生的非特异性扩增时，和/或抑制引物二聚体产生的非特异性扩增时,加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna。

7.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna的茎部长度为8bp-10bp、环部长度为3nt-6nt、5’-凸出端长度为5nt-7nt时，在55℃-72℃退火温度下，对于背景dna存在条件下非特异性扩增产物的抑制。

8.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：在高背景核酸条件下的扩增体系中，加入带有5’-凸出端和短茎环结构的寡聚dna，针对低模板浓度、高背景dna浓度条件下的非特异性扩增进行抑制。

9.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：所述核酸扩增为背景dna存在条件下的恒温扩增、pcr反应体系扩增中的一种。

10.根据权利要求1所述的寡聚dna抑制非特异性扩增的方法，其特征在于：5’端凸出长度为5nt-7nt，此时dna聚合酶与该结构处于动态结合的状态，使得该结构难被聚合酶延伸。

技术总结
本申请公开了一种寡聚DNA抑制背景DNA存在条件下非特异性扩增产物的方法，属于核酸扩增领域。针对现有技术中存在的“非特异性扩增严重影响核酸扩增的灵敏度和特异性，且现有抑制方法存在难以高效抑制、序列设计繁琐等”的问题，本申请的技术方案中，在核酸扩增时，加入带有5’‑凸出端和短茎环结构的寡聚DNA，适用于恒温扩增、PCR反应体系扩增(变温扩增)中。本申请的技术方案不需根据模板序列进行特异性的设计，仅需10nM‑500nM寡聚DNA即可实现对非特异性扩增的高效抑制，不需要进行修饰，大大降低了成本，既可以抑制引物与非目标片段结合产生的非特异性扩增，还可以抑制引物二聚体，尤其可抑制高背景DNA条件下产生的非特异性扩增。

技术研发人员：梁兴国,宋子婷,安然,胡坤灵,杜书涵
受保护的技术使用者：中国海洋大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15