一种断裂点簇集区艾贝乐逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用与流程

本发明属于核酸检测，具体涉及一种断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品及其制备方法和应用。

背景技术：

1、微小残留(minimal residual disease，mrd)白血病是指白血病患者按照目前的疗效标准经过治疗取得完全缓解(complete remission，cr)后体内残存微量白血病细胞的状态。据研究表明，若mrd的数量在10-4以上时(即10000个正常细胞中存在1个白血病细胞)，急性白血病复发的可能性就非常大，低于10-4也存在复发的可能性，因此准确判定血液中的mrd状态对于白血病的预后判定非常重要。其中以t(9；22)(q34；q11)染色体易位形成的断裂点簇集区(breakpoint cluster region,bcr)-艾贝尔逊白血病病毒(abelson leukemiavirus,abl1)融合基因为主要标志，简称为bcr-abl。目前由于bcr-abl1基因水平的检测简单准确、意义明确而被采用作为mrd的检测指标，国际临床试验结论以及此类白血病治疗指南的制定也均来自于bcr-abl1，以％is(international standard，国际标准)为单位报告。目前临床上检测bcr-abl1的“金标准”是依赖于标准物质的荧光定量pcr技术，一般检测灵敏度为0.01％

2、is(mr4.0)，即在10000个正常细胞中可以检出1个白血病细胞，而mrd有效的监测和治疗检测灵敏度需要达到0.002％is(mr4.7)以下，如果可以更早在正常细胞中检测出白血病细胞，即达到0.001％is(m r5.0)甚至更低的mrd检测技术，那么就会更早发现白血病复发的状况，为患者更早提供治疗方案，大大延长患者的生存期。数字pcr技术不依赖于标准物质，并且具有更高的检测灵敏度，对于mrd的检测可以达到0.001％is(mr5.0)。但是由于目前缺乏相关的校准品导致多家检测机构结果无可比性、缺乏统一溯源性以及标准化报告，研究者主要通过交换样本进行溯源，但由于样本的可及性以及样本量体积及浓度的限制使其在实际应用中存在较大的局限性。因此，断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准物质或者标准物质的制备及应用将为此研究领域的需求者提供强有力的支持。

3、校准物(calibrator)是用于体外诊断仪器或系统校准的测量标准。在规定条件下的一组操作中，第一步建立由测量标准给出的带有测量不确定度的量值与相应的带有测量不确定度的测量示值的关系；第二步用这些信息建立由一个示值获得测量结果的关系。校准的结果可以是将被测量的值赋于测量仪器给出的测量示值，或是确定测量仪器给出值的修正值。目前尚缺乏稳定和性能优良的bcr-abl1的校准品对检测平台进行校准。

技术实现思路

1、鉴于上述原因，本发明的目的是提供一种断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品。本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品一套共5管，最低校准品的检测范围可以达到0.001％is(mr 5.0)，并且能够作为第三方校准品对荧光定量pcr检测平台及数字pcr检测平台进行校准使用；该套校准品适用于荧光定量pcr方法及数字pcr方法对断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒检测的试剂盒；同时，本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒的校准品具有良好的长稳定性，能够长期在2～8℃条件下保存且便于运输。

2、为了实现上述发明目的，本发明提供了一种断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品，包括以下组分：ws1、ws2、ws3、ws4、ws5各一管；ws1、ws2、ws3、ws4、ws5为k562细胞和h l60细胞的混合物；其中，ws1、ws2、ws3、ws4每一管中的细胞总数量为1.5×106～1.8×106，ws5的细胞总数量为3×106～5×106。

3、优选地，所述校准品包括：按细胞数量百分比计，ws1为k562细胞数量和hl60细胞数量以0.1～1％的比例进行混合的细胞混合物、ws2为k562细胞数量和hl60细胞数量以0.01～0.1％的比例进行混合的细胞混合物、ws3为k562细胞数量和hl60细胞数量以0.001～0.01％的比例进行混合的细胞混合物、ws4为k562细胞数量和hl60细胞数量以0.0001～0.001％的比例进行混合的细胞混合物、ws5为k562细胞数量和hl60细胞数量以0.00001～0.0001％的比例进行混合的细胞混合物。

4、优选地，本发明的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品为冻干粉。

5、本发明的另一目的提供一种断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品的制备方法，包括以下步骤：

6、s1：将k562细胞和hl60细胞培养至细胞数量及细胞活力必须达标后方可进行校准品的配制；

7、s2：对达标的k562细胞使用细胞保存液稀释至每毫升细胞保存液中含2×106个细胞的k562细胞悬浮液，对达标的hl60细胞使用细胞保存液稀释至每毫升细胞保存液中含3×107个细胞的hl60细胞悬浮液，吹吸混匀细胞悬浮液并进行记录。为防止细胞产生沉降，每次吸取细胞悬浮液或者细胞混合物之前应至少吹吸5次，以保证细胞在细胞悬浮液中充分悬浮；

8、s3：按照ws1所需的细胞总数及细胞数量混合比例计算出所需k562和hl60细胞悬浮液的体积并分别吸取所需两种细胞相应体积的细胞悬浮液混合成为细胞混合液，即校准品ws1；

9、s4：取1/10体积的校准品ws1与hl60细胞悬浮液进行混合成为校准品ws2，其中hl60细胞悬浮液的使用体积为ws1中使用的hl60细胞悬浮液的9/10；

10、s5：取1/10体积的校准品ws2与hl60细胞悬浮液进行混合成为校准品ws3，其中hl60细胞悬浮液的使用体积为ws2中使用的hl60细胞悬浮液的9/10；

11、s6：取1/10体积的校准品ws3与hl60细胞悬浮液进行混合成为校准品ws4，其中hl60细胞悬浮液的使用体积为ws3中使用的hl60细胞悬浮液的9/10；

12、s7：取1/10体积的校准品ws4与hl60细胞悬浮液进行混合成为校准品ws5，其中hl60细胞悬浮液的使用体积为ws4中使用的hl60细胞悬浮液的9/10；

13、s8：提取校准品ws1至ws5的rna后并使用数字pcr方法测定bcr-abl1拷贝数与abl1拷贝数的％is值，测定％is值在合格范围内方可进行分装；

14、s9：将断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品ws1至ws5根据需要的分装量进行分装并于800g离心10min，设置转速缓降，离心后使用移液器轻轻吸净上清；

15、s10：将分装好的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品进行冻干处理，冻干后的校准品在2℃～8℃条件下保存，冻干程序如下表1：

16、表1、断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品冻干程序

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19、优选的，步骤s2中细胞保存液为使用depc水配制的8mm磷酸氢二钠、2mm磷酸二氢钠、140mm氯化钠、10mm柠檬酸钠。

20、优选的，步骤s8中所述％is值在合格范围内方可进行分装，即校准品ws1的bcr-abl1的拷贝数与abl1拷贝数的比值(％is)为3.1623～31.6228％；校准品ws2的bcr-abl1拷贝数与abl1拷贝数的比值(％is)为0.3162～3.1623％；校准品ws3的bcr-abl1拷贝数与abl1拷贝数的比值(％is)为0.0316～0.3162％；校准品ws4的bcr-abl1拷贝数与abl1拷贝数的比值(％is)为0.0032～0.0316％；校准品ws5的bcr-abl1拷贝数与abl1拷贝数的比值(％is)为0.0003～0.0032％。

21、本发明的另一个目的是提供上述断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品或上述制备方法在数字pcr以及荧光定量pcr平台的应用。

22、优选地，断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品使用时对冻干粉不用复溶处理，仅需室温10000rpm离心30秒后，使用经计量合格的移液器加入rna裂解液进行rna提取，之后使用配套的试剂盒及检测设备进行测定后确定校准品的靶值及合格范围。

23、相对于现有技术，本发明具有的有益效果为：

24、1、本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品一套共5管，ws1、ws2、ws3、ws4、ws5各一管，校准品的最低检测范围达到0.001％is(mr5.0)并经过严格的赋值，能够作为第三方校准品使用；

25、2、本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品适用于荧光定量pcr检测平台及数字pcr检测设备的校准；

26、3、本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品适用于荧光定量pcr方法及数字pcr方法对断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒进行检测的试剂盒；

27、4、本发明提供的断裂点簇集区·艾贝尔逊白血病病毒校准品和外周血样本具有互换性，无基质效应。