一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒及应用的制作方法

本发明涉及结核分型领域，特别涉及一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒及应用。

背景技术：

1、结核病是由结核分枝杆菌引起的传染病，它可以分为两种状态：结核潜伏和活动性结核。结核潜伏是指一个人感染了结核分枝杆菌，但尚未出现疾病症状，在结核潜伏状态下，感染者没有活动性结核病的症状，具有传染性，也可能患上活动性结核病；活动性结核是指感染者的免疫系统无法控制结核分枝杆菌的生长，导致疾病症状出现并有传染性。由于不论是结核潜伏还是活动性结核的患者，其体内均是含有结核分枝杆菌的，这导致现有技术的数字pcr技术并不能直接区分正常人、结核潜伏和活性性结核的患者。

2、具体来说，数字pcr虽然可以检测结核分枝杆菌的核酸，通过比较目标基因的拷贝数或表达水平，可以对结核分枝杆菌的存在和数量进行定量分析，但是仅提供了关于结核分枝杆菌的存在和数量的信息，而无法区分结核潜伏和活动性结核，这是由于在结核病的不同状态下，结核分枝杆菌的核酸水平可能存在重叠或变化不明显，无论是活动性结核还是结核潜伏，都可能存在结核分枝杆菌的dna或rna，进而导致数字pcr技术仅能区分是否为结核感染但无法区分是活动性结核，进而限制了数字pcr在结核检测领域的应用。

技术实现思路

1、本发明提供了一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒及应用，利用stat1基因、parp14基因以及epha4三种基因的转录水平的检测，以转录水平适中的parp14转录水平检测值作为分母利用三基因打分法得到打分值，基于打分值有效区分正常人、结核潜伏患者以及活动性结核患者。

2、本方案选择stat1基因、parp14基因以及epha4这三种基因作为结核感染宿主标志基因，这三个基因在应对病原菌感染时都会发生一定的变化：stat1蛋白通过指导对干扰素和其他细胞因子的转录反应，从而保护宿主免受病原体感染，在先天免疫中起着至关重要的作用；parp14被认为是stat6(coast6)的合作者，因为它能够促进il-4依赖的转录，它的宏观结构域可以通过与stat6合作来增强il-4诱导的基因表达，有助于转导il-4信号，促进成熟b细胞的代谢适应性和存活；此外，parp14还影响抗体反应的类别分布、亲和库和回忆能力，并为t辅助分化需要蛋白单adp核糖基化；epha4可能通过mtor、p-akt和nf-κb通路调节作用,抑制单核细胞/巨噬细胞抗炎极化状态，epha4缺失或epha4肽被抑制后体外lps刺激促炎基因的表达衰减表明，epha4可能是tbi后炎症和继发性损伤增加的原因。有研究结果表明，与il-10、精氨酸酶1、angpt2和tgfβ相比，epha4的抑制可能会使炎症反应向促分解状态转变，这可以从il-6、il-8、il-12和tnf的表达变化中看出。epha4缺失的单核细胞/巨噬细胞极化为m1促炎表型，它们表现出较少的cd86、il-12p40、ccr2和mcp1。

3、本技术人研究发现stat1基因在结核病的发病和免疫反应中发挥重要作用。stat1缺陷或功能异常可能导致免疫反应受损，增加感染结核分枝杆菌(mycobacteriumtuberculosis)的风险；parp14基因的过度激活可能导致免疫细胞功能异常，影响对结核分枝杆菌的清除能力，一些研究发现parp14基因的变异可能与结核病的易感性和严重程度相关；epha4在炎症和免疫反应发挥作用。另外，虽然不同病株感染也会引起stat1基因、parp14基因以及epha4这三种基因的变化，但是活动性结核以及结核潜伏引起的变化量是不一样的，故本方案通过三种基因的转录水平的检测值进行打分，基于打分得到的分值区分正常人、活动性结核以及结核潜伏，具有强特异性。

4、另外，本方案开发的检测体系使用同一扩增体系的不同通道同时检测三个基因，也就是说，一个样本的三个基因在同一个扩增管中进行扩增，这样的好处在于可以确保加样量完全一致而不需要持家基因的归一化。且因为不同患者单核细胞的含量差异较大，单核细胞的收集量差异也较大，因此不同样本的总rna量存在差异，检测时即使加相同体积的模板，不可避免检测值亦存在较大差异，为了避免扩增时模板总量不同造成的差异，本方案选择三个基因中转录水平比较适中的parp14检测值作为分母，其他基因的检测值作为分子进行检测值标准化处理，利用三个基因的转录水平的检测值进行打分，基于得到的分值判断患者是否被结核分枝杆菌感染，以及感染的类型属于结核潜伏还是活动性结核阶段。

5、第一方面，本方案提供了一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒的应用，其中检测的基因为stat1基因、parp14基因以及epha4基因，包括：获取stat1基因、parp14基因以及epha4基因的转录水平，按照如下公式计算得到三基因得分：

6、三基因得分＝stat1/2parp14-epha4/parp14+1/2；

7、其中stat1为stat1的转录水平，parp14为parp14的转录水平，epha4是epha4的转录水平，若三基因打分在第一区间则判断为正常，在第二区间为结核潜伏，大于第二区间的上限阈值为活动性结核。

8、在一些实施例中，若三基因得分在-1.5-0之间则判断为正常，若三基因得分在0-1.0之间判断为结核潜伏，大于1.0判断为活动性结核。

9、在一些实施例中，通过数字pcr方法进行三个基因转录水平进行检测。数字pcr的检测原理是通过分区扩增后检测所有反应单元的荧光信号，利用数字模型校正直接计算出目标靶分子的浓度或者拷贝数，无需对照标准样本和标准曲线，不依赖于ct值就可以实现绝对定量分析。

10、在一些实施例中，在同一扩增体系的不同通道内检测三个基因，获取对应通道的检测值作为基因的转录水平。

11、在一些实施例中，将stat1基因、parp14基因以及epha4基因以及外源内参的引物探针混合得到引物探针混合液，并混合所述引物探针混合液制备ddpcr反应体系，将待测血液样本提取的rna和ddpcr反应体系混合后在设定的扩增程序下进行扩增检测得到stat1基因、parp14基因以及epha4基因的转录水平的检测。

12、在一些实施例中，特异性扩增stat1基因的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示，对应的标记序列如seq id n0:14所示。在一些实施例中，特异性检测stat1基因的探针序列的修饰荧光基团为fam和mgb。

13、在一些实施例中，特异性扩增parp14基因的引物序列如seq id no:4和seq idno:5所示，探针序列如seq id no:6所示，对应的标记序列如seq id n0:15所示。在一些实施例中，特异性检测parp14基因的探针序列的修饰荧光基团为rox和mgb。

14、在一些实施例中，特异性扩增epha4基因的引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示，对应的标记序列如seq id n0:16所示。在一些实施例中，特异性检测epha4基因的探针序列的修饰荧光基团为vix和mgb。

15、本方案还随机生成了如seq id no:10-11的随机引物和seq id no:12的探针作为外源内参，对应的标记序列如seq id n0:13所示。

16、具体的序列如表一所示：

17、表一 序列表

18、

19、

20、第二方面，本方案提供了一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒，包括：

21、特异性扩增stat1基因的引物序列如seq id no:1和seq id no:2所示，探针序列如seq id no:3所示；

22、特异性扩增parp14基因的引物序列如seq id no:4和seq id no:5所示，探针序列如seq id no:6所示；

23、特异性扩增epha4基因的引物序列如seq id no:7和seq id no:8所示，探针序列如seq id no:9所示。

24、在一些实施例中，该试剂盒以数字pcr方式检测stat1基因、parp14基因和epha4基因，在同一扩增管的不同通道内进行检测，获取不同通道的检测值作为对应基因的转录水平，按照以下公式计算得到三基因打分：

25、三基因得分＝stat1/2parp14-epha4/parp14+1/2；

26、其中stat1为stat1的转录水平，parp14为parp14的转录水平，epha4是epha4的转录水平，若三基因打分在第一区间则判断为正常，在第二区间为结核潜伏，大于第二区间的上限阈值为活动性结核。

27、在一些实施例中，该试剂盒还包括如seq id no:10-11的随机引物和seq id no:12的探针作为外源内参。

28、在一些实施例中，数字pcr检测试剂盒还包括：水、ddpcr mix，序列如seq id n0:13所示的标记序列。

29、在一些实施例中，扩增程序为：55℃10min,；95℃5min；【95℃15s，60℃30s】*45。

30、在一些实施例中，针对待测患者的血液样本进行检测。

31、第三方面，本方案提供了一种基于三基因打分法检测结核分型的试剂盒的应用，用于非诊断目的的结核检测，且区分结核潜伏或者活性结核。

32、相较于现有技术，本技术方案具有以下特点和有益效果：

33、本方案利用数字pcr扩增技术在同一扩增管的不同通道内同时检测stat1基因、parp14基因和epha4基因的转录水平，不需要持家基因的归一化。且为了避免扩增时模板总量不同而带来的差异，本方案选用三个基因中转录水平适中的parp14基因的检测值作为分母对其他通道的基因检测值进行标准化处理，利用三个基因的转录水平的变化关系计算得到三基因打分，通过三基因打分进行结核感染的判断，且可高效鉴别结核潜伏和活动性结核，具有特异性更高结果更准确的效果。另外，本方案设计了针对三个基因的引物探针序列，可更为准确地检测到对应的基因转录水平。