生成人类鼻咽三维和二维类器官的非侵入式方法与流程

本发明涉及获得成体干细胞生成人类三维和二维类鼻咽(np)类器官的方法。更具体地说，本发明提供了一种产生人类鼻咽类器官的非侵入性方法，其可作为研究新发呼吸道病毒(如流感病毒和冠状病毒)的发病机制和向性的创新的离体模型。

背景技术：

1、迄今为止，流感病毒和冠状病毒等呼吸道病毒的传播和发病机制主要通过使用实验动物模型或体外细胞培养进行研究。传统上，小鼠被用作流感病毒和冠状病毒(如严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2型，sars-cov-2)发病机制的小型哺乳动物模型，但大多数人类病毒在没有预先适应的情况下,不能在小鼠中进行有效复制。小鼠体内缺乏可与人类呼吸道病毒相似的临床症状，这也限制了它们作为病毒传播模型的实用性。

2、相反，雪貂被用作流感和冠状病毒感染的发病机制和传播性的一个有吸引力的模型。人类和禽流感病毒以及冠状病毒可以在雪貂呼吸道中有效复制，而不需预先适应，并且受感染的雪貂在实验性病毒接种后展现许多人类中观察到的临床症状。已证明病毒可通过直接接触或呼吸道飞沫在受感染雪貂和未感染病毒的雪貂之间成功传播，因此雪貂可作为人类流感疾病和冠状病毒感染的精确模型。雪貂模型既昂贵又生产率低，而且在给定的实验中可以使用的动物数量有限，这使得很难获得用于统计分析的稳健数据。虽然永生化细胞系的体外二维单层细胞培养在研究细胞生物学和宿主调控方面有价值，但其未能重建体内细胞微环境。

3、成体干细胞或多能干细胞衍生的类器官具有三维(3d)结构，由具有组织特异性的分化细胞类型组成，因此为究新发的呼吸道病毒的发病机制和向性提供了一个具有吸引力的新方法。据报道，类器官培养物在长期冷冻保存后能够保留其典型的形态特征和结构，使其成为一种易于临床应用的工具。基于可用于病毒感染的分化良好的人类细胞类型，类器官可忠实地复制人类病理。几项研究报道了从人类多能干细胞产生代表肺部不同区域的类器官，包括细支气管类器官、支气管-肺泡类器官和肺泡球体。由此产生的结构由在该特定器官中发现的多种细胞类型组成，并且这些细胞能够执行与原生器官类似的功能。结合类器官模型的「现成」和「不断增长」的特性，这些特征使类器官成为一种有吸引力的传染性疾病模型。

4、尽管人类鼻咽组织的离体外植体培养物是迄今为止用于评估流感病毒和冠状病毒趋向性最符合生理学的人类呼吸道模型，且现在已被验证为动物流感病毒大流行威胁风险评估的参数，并被列为who「流感大流行风险评估工具」中的一个参数，但从切除的人类鼻咽中获得的组织的可用性有限，离体存活的持续时间有限，并且很难控制供体与供体之间的变异性。

5、此外，缺乏稳健和可重复的人类呼吸道上皮体外培养模型，阻碍了对呼吸道病毒与宿主之间相互作用以及呼吸系统病理学的理解。成体干细胞衍生类器官的建立依赖于侵入性采样技术来获得受试者/患者样本。

6、因此，有必要开发更具生理相关性的人类呼吸道上皮的体外模型。

技术实现思路

1、因此，本发明描述了一种生成人类鼻咽类器官的方法，其提供了一种保留上皮细胞在其原生三维(3d)环境中的模型。为了便于各种病原体的接触，这些类器官可以转换为二维(2d)模型，使病原体能够从顶端和基底外侧室与上皮细胞相互作用。无论是三维还是二维类器官模型,都将成为研究流感病毒和冠状病毒等新发病毒的传播、向性和宿主先天反应的有用工具。这些模型有助于评估病毒的病理生理特征。

2、在第一个方面，本发明提供了一种用于生成人类鼻咽(np)类器官的非侵入性方法，其用作研究新发病毒的向性和发病机制的新型离体模型。该方法包括非侵入性采集鼻咽拭子样本；在含有一种或多种生态位因子的基质中培养鼻咽拭子样本，以刺激三维鼻咽类器官的生长；在基质中培养鼻咽拭子样本14-21天后，获得一种或多种人类三维鼻咽类器官。

3、根据本发明的一个态样，三维鼻咽类器官具有球形结构,平均直径在20微米至100微米之间。

4、根据本发明的一个态样，生态位因子包括成纤维细胞生长因子、激活wnt信号传导泌性蛋白r-spondin和骨形态发生蛋白抑制剂noggin。

5、根据本发明的一个态样，使用酶及/或机械剪切传代在第14天培养的一种或多种人类三维鼻咽类器官。

6、根据本发明的一个态样，所述酶包括非动物来源的重组酶。

7、所述酶包括trypletm-express酶。tryple是一种特定的胰蛋白酶溶解剂，被广泛应用于细胞生物学和细胞培养实验中。tryple是由thermo fisher scientific生产的一种商业化的胰蛋白酶溶解剂。与传统的胰蛋白酶相比，tryple具有以下优势：(1)高效：tryple能够更快速、有效地消化细胞表面上的蛋白质连接，使细胞更容易分散并单独进行培养；(2)稳定性高：tryple在培养液中的表现出更高的稳定性，不容易失活或降解；(3)可重复性：tryple的组成经过严格控制，具有一致的酶活性和效能，有助于实验的重复性和可靠性。

8、根据本发明的一个态样，一种或多种人类三维鼻咽类器官富含p63a+上皮细胞、scgb1a1/cc10+分泌细胞、乙酰化-α-微管蛋白+纤毛细胞和muc5ac+粘液分泌杯状细胞。

9、根据本发明的一个态样，所述人类三维鼻咽类器官包含四种呼吸近道端上皮细胞类型，包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞和杯状细胞。

10、根据本发明的一个态样，人类三维鼻咽类器官是研究包含流感病毒在内的新发呼吸道病毒的传播、向性和宿主先天反应的有用工具。这些模型有助于评估病毒的病理生理特征。

11、在本发明的第二个方面，根据第一方面的方法获得一种或多种人类三维鼻咽类器官。之后，将一种或多种人类三维鼻咽类器官分离成单细胞悬浮液，用于产生一种或多种人类二维鼻咽类器官。

12、根据本发明的一个态样，将解离成单细胞悬浮液的一种或多种人类三维鼻咽类器官进一步接种在预涂有鼠尾胶原蛋白i型的细胞培养插入物(小室)中，直到单层细胞达到100％汇合度。当达到融合单层时，细胞分化至少8天。

13、根据本发明的一个态样，人类二维鼻咽类器官包含四种呼吸近道端上皮细胞类型，包括基底细胞、分泌细胞、纤毛细胞和杯状细胞。纤毛细胞在人类二维鼻咽类器官中大量增加。例如，在一种或多种人类二维鼻咽类器官中的纤毛细胞比在一种或多种人类三维鼻咽类器官中增加了24倍。

14、根据本发明的一个态样，人类二维鼻咽类器官是研究包含冠状病毒在内的新发呼吸道病毒的传播、向性和宿主先天反应的有用工具。这些模型有助于评估病毒的病理生理特征。

15、根据本发明的一个态样，鼻咽类器官的细胞形态在生理上与人类鼻咽相似，具有纤毛、分泌细胞、杯状细胞和基底细胞，通过细胞间连接复合体紧密结合在一起。鼻咽类器官的唾液酸(sa)谱显示saα2,3gal和saα2,6gal的高表达，与人类鼻咽的唾液酸谱相似。被公开的二维(2d)分化的鼻咽类器官，其包含基底细胞、分泌细胞杯状细胞和富集的纤毛细胞。

16、根据本发明的另一个方面，该方法包括在三维和二维鼻咽类器官中评估新发呼吸道病毒如流感病毒(流行的h5n1和h1n1)和冠状病毒(sars-cov-2变体)的传染性、向性和发病机制。