一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法与应用与流程

本发明涉及单细胞测序，尤其是涉及一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法与应用。

背景技术：

1、肝脏是人体内最重要的代谢器官，具有制造凝血因子、净化血液等功能，此外肝脏对抵御病原体的入侵，如吞噬、杀伤及清除致病微生物等也具有重要作用。但随着人类生活水平提高，由不良习惯引发的脂肪肝、肝炎、肝硬化以及肝癌等疾病严重危害着人类生命健康，因此研究肺组织细胞的主要细胞类型与稀有细胞类型，挖掘肝脏组织细胞的异质性对进一步深入了解肝脏疾病的生理机制具有重要作用。

2、相关技术中，制备肝脏组织单细胞悬液并采用单细胞测序技术探究不同免疫微环境是筛选有关肝脏疾病新治疗方案或新靶向药物的重要环节，然而在肝脏组织单细胞悬液制备过程中常出现解离时间过长、细胞死亡率较高、细胞碎片多、细胞背景不干净或损伤细胞聚集导致细胞结团等现象，严重影响着测序数据的质量。

3、因此，亟需寻求一种高效的肝脏组织单细胞快速解离试剂盒及解离方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出了一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒、解离方法与应用，采用本发明的肝脏组织单细胞快速解离试剂盒和解离方法获取的单细胞悬液具有细胞活性和细胞浓度高、细胞结团率低和细胞背景干净等优点，可广泛应用于单细胞测序和流式/磁性细胞分选。

2、本发明提出了一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒。

3、本发明还提出了一种肝脏组织单细胞解离方法。

4、本发明还提出了一种单细胞悬液。

5、本发明还提出了一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒或解离方法在单细胞测序、流式/磁性细胞分选中的应用。

6、本发明的第一方面，提供了一种肝脏组织单细胞快速解离试剂盒，包含组织解离酶a液、组织解离酶b液和细胞清洗缓冲液；其中，

7、所述组织解离酶a液包含磷酸盐缓冲液和0.20～0.3wt％的胰蛋白酶；

8、所述组织解离酶b液包含平衡盐溶液、浓度为0.8～1.2mg/ml的胶原酶i、浓度为0.8～1.2mg/ml的胶原酶ⅱ、浓度为6.5～8.0μg/ml的dnase i和浓度为2～2.5u/ml的dispaseⅱ；

9、所述细胞清洗缓冲液包含磷酸盐缓冲液和牛血清白蛋白，所述牛血清白蛋白的浓度为0.01～0.15wt％。

10、根据本发明实施例的肝脏组织单细胞快速解离试剂盒，至少具有如下有益效果：

11、(1)本发明通过合理搭配酶的种类并对其含量进行筛选，有效提高了肝脏组织的解离效率。在常规肝脏组织解离过程中，通常采用胶原酶ⅱ和胶原酶ⅳ的组合方式进行酶解处理，然而在实际应用中其解离效果并不理想，而本发明通过利用胰蛋白酶和胶原酶的搭配，使得肝脏组织的解离效果更好。

12、(2)在本发明的组织解离酶a液中通过合理搭配磷酸盐缓冲液和胰蛋白酶有效提高了对细胞间质较少的浅层肝脏组织的解离效果，而对于难以解离的肝脏组织内部，则通过在组织解离酶b液中搭配胶原酶i和胶原酶ⅱ，以便于提高解离强度的同时降低对细胞的损伤。

13、(3)本发明的组织解离酶b液中还添加了脱氧核糖核酸酶ⅰ(deoxyribonucleaseⅰ，以下简称dnaseⅰ)和dispaseⅱ，其中dnaseⅰ能够作用于细胞分离降解出的dna，防止dna导致的细胞凝集，dispaseⅱ作为一种快速有效且温和的细胞消化酶，其稳定性强，不受温度、ph及血清组分的影响，对于维持细胞膜完整性和防止细胞聚集有较好的效果。

14、(4)本发明的细胞清洗缓冲液包含磷酸盐缓冲液和牛血清白蛋白，磷酸盐缓冲液除了nacl外，还有kcl、na2hpo4和kh2po4成分，可以在温度、气体组成变化时缓冲，且其能保证正常的ph和渗透压，对细胞膜和离子通道有更好的保护作用，相对于常规的生理盐水清洗缓冲效果更佳。

15、在本发明的一些实施方式中，所述组织解离酶b液中还包含抗生素-抗真菌药、丙酮酸钠和mem非必需氨基酸中的至少一种；

16、具体地，所述抗生素-抗真菌药为2×抗生素-抗真菌药，更具体的，所述抗生素-抗真菌药为青霉素-链霉素-两性霉素b。

17、所述丙酮酸钠的浓度可以为0.08～0.13mg/ml，更具体的，所述丙酮酸钠的浓度可以为0.11mg/ml。

18、在本发明的一些实施方式中，所述mem非必需氨基酸为1×mem非必需氨基酸。

19、在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液由氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾和水组成；

20、具体的，所述磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为7.89～8.07mg/ml、氯化钾的浓度为0.19～0.20mg/ml，磷酸氢二钠的浓度为1.14～1.70mg/ml，磷酸二氢钾的浓度为0.20～0.34mg/ml。

21、更具体的，所述磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为7.95～8.00mg/ml、氯化钾的浓度为0.198～0.199mg/ml，磷酸氢二钠的浓度为1.28～1.42mg/ml，磷酸二氢钾的浓度为0.20～0.27mg/ml。

22、在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液中氯化钠的浓度为8.00mg/ml、氯化钾的浓度为0.199mg/ml，磷酸氢二钠的浓度为1.42mg/ml，磷酸二氢钾的浓度为0.27mg/ml。

23、在本发明的一些实施方式中，所述磷酸盐缓冲液的ph值为7.3～7.5。

24、在本发明的一些实施方式中，所述平衡盐溶液为hbss平衡盐溶液。

25、具体的，所述hbss平衡盐溶液中不包含钙、镁和酚红。

26、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包含红细胞裂解液；

27、具体的，所述红细胞裂解液包含体积分数为0.08～0.12wt％的depc水溶液、浓度为7.76～8.29mg/ml的氯化铵、浓度为0.80～1.20mg/ml的碳酸氢钾和浓度为0.02～0.04mg/ml的乙二胺四乙酸。

28、在本发明的一些实施方式中，所述红细胞裂解液包含体积分数为0.08～0.1wt％的depc水溶液、浓度为7.76～8.02mg/ml的氯化铵、浓度为0.80～1.00mg/ml的碳酸氢钾和浓度为0.02-0.03mg/ml的乙二胺四乙酸。

29、具体的，所述红细胞裂解液包含体积分数为0.1wt％的depc水溶液、浓度为8.02mg/ml的氯化铵、浓度为1.00mg/ml的碳酸氢钾和浓度为0.03mg/ml的乙二胺四乙酸。

30、本发明的第二方面，一种肝脏组织单细胞解离方法，采用上述的肝脏组织单细胞快速解离试剂盒对肝脏组织进行解离，所述解离方法包括如下步骤：

31、步骤s1、去除肝脏组织表面杂质，加入部分所述组织解离酶a液并将所述肝脏组织剪成小于1～3mm3的组织块，得到混合物；

32、步骤s2、将所述混合物与另一部分所述组织解离酶a液混合，进行第一次消化，离心去上清，然后加入所述细胞清洗缓冲液重悬细胞，过滤，得到细胞悬液a和未消化的组织沉淀；

33、步骤s3、向所述未消化的组织沉淀中加入组织解离酶b液，进行第二次消化，离心去上清，然后加入所述细胞清洗缓冲液重悬细胞，过滤，取滤液得到细胞悬液b，然后将所述细胞悬液b与所述细胞悬液a合并，离心，得细胞沉淀i；

34、步骤s4、采用所述红细胞裂解液将所述细胞沉淀i重悬，进行第三次消化，离心去上清，然后加入所述细胞清洗缓冲液重悬细胞，即得肝脏组织单细胞悬液。

35、根据本发明实施例的解离方法，至少具有如下有益效果：采用本发明方法进行解离能够提高细胞解离效率、降低细胞结团率。此外，在本发明的解离方法中，组织解离酶a液采用了分步加入的方式，首先在肝脏组织中加入部分组织解离酶a液，并将肝脏组织剪成小于1～3mm3的组织块，该过程能够缓冲剪碎时的机械损伤影响，对细胞活性的提升具有一定的促进作用，其次在肝脏组织剪碎后再加入另一部分组织解离酶a液，有利于提高消化效果。

36、在本发明的一些实施方式中，所述肝脏组织与所述组织解离酶a液总添加量的质量体积比为40～60mg：1ml。

37、具体的，所述组织块与所述组织解离酶a液的质量体积比可以为50～60mg：1ml。

38、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述过滤的网筛孔径小于50μm；

39、优选地，所述过滤的网筛孔径为35～45μm。

40、在本发明的一些实施方式中，所述第一次消化的温度为25±2℃，时间为5～10min。

41、在本发明的一些实施方式中，所述第二次消化的温度为37±2℃，时间为10～20min。

42、在本发明的一些实施方式中，所述第三次消化的温度为25±2℃，时间为12～15min。

43、在本发明的一些实施方式中，所述消化过程中每4～6分钟上下颠倒混匀一次。

44、在本发明的一些实施方式中，步骤s2中，所述离心的条件为300～350×g，4～6min。

45、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述离心的条件为300～350×g，4～6min。

46、在本发明的一些实施方式中，步骤s4中，所述离心的条件为280～320×g，4～6min。

47、在本发明的一些实施方式中，步骤s3中，所述未消化的组织沉淀与组织解离酶b液的重量体积比为50mg：0.8～1.2ml。

48、具体的，所述未消化的组织沉淀与组织解离酶b液的重量体积比为50mg：1ml。

49、本发明的第三方面，提供采用上述的肝脏组织单细胞解离方法得到的单细胞悬液。

50、根据本发明实施例的单细胞悬液，至少具有如下有益效果：采用本发明的肝脏组织单细胞解离方法得到的单细胞悬液具有细胞活性和细胞浓度高、细胞结团率低和细胞背景干净等优点，可广泛应用于单细胞测序和流式/磁性细胞分选。

51、本发明的第四方面，提供一种单细胞悬液在单细胞测序、流式/磁性细胞分选中的应用

52、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。