一种柯萨奇病毒B组4型毒株及应用

本发明涉及生物医药，更具体地说是涉及一种柯萨奇病毒b组4型毒株及其应用。

背景技术：

1、柯萨奇病毒b组4型（coxsackievirus b4，cvb4）属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属，是b组柯萨奇病毒（cvb）的一个主要成员。cvb4感染会引起多种不同程度的疾病或症状，如手足口病（hand foot mouth disease，hfmd）、脑炎、心肌炎、无菌性脑膜炎甚至死亡。cvb4的感染中新生儿和儿童感染的风险较高，能够引起新生儿急性心肌炎和脑膜炎，存在着较高的致死风险，并且妊娠期间cvb4的感染可导致患有先天性心脏病变的婴儿出生。此外，cvb4还与1型糖尿病（t1dm）密切相关，临床研究发现，在子宫内和儿童期暴露于肠道病毒感染能够诱导胰岛β细胞损伤，并在持续感染中发展为t1d。长期以来，cvb4在全球范围内持续传播流行。美国1970-2005年的肠道病毒检测报告指出，cvb4占已知血清型报告的4.2%，而且一直出现在15种最常见的肠道病毒中。波兰、法国、意大利等多个国家亦有cvb4相关报告。从已有的文献来看，在中国，cvb4的病例多为散发病例。鉴于目前我国对hfmd的监测仍主要针对肠道病毒71型（enterovirus 71, ev71）、柯萨奇病毒a16型（coxsackievirus a16, cva16）、柯萨奇病毒a6型（coxsackievirus a6, cva6）和柯萨奇病毒a10型（coxsackievirus a10, cva10）等少数几个血清型来开展，包括cvb4在内的其它血清型在国内的流行情况很可能被低估。作为预防疾病最为经济、有效的措施之一，很有必要尽快开发出针对cvb4的单价或包含cvb4抗原成分的多价预防性疫苗。

2、迄今，尚无针对cvb4的疫苗或特异性抗病毒药批准上市。目前，肠道病毒领域内，仅有脊髓灰质炎病毒的减毒和灭活疫苗以及针对肠道病毒71型的灭活疫苗上市使用。不过以上疫苗对该血清型以外的其它血清型肠道病毒并无交叉保护作用。当前，针对b组柯萨奇病毒的疫苗研究主要是国外的研究人员和机构在推进。上世纪90年代，美国加州大学研究人员see等测试了福尔马林灭活柯萨奇病毒b1-6原型株开发的多价疫苗在小鼠中的功效，该疫苗可降低柯萨奇b组病毒临床株急性感染的严重程度。近年，瑞典学者stone等进行了新型实验性六价cvb疫苗的开发和临床前测试，该疫苗在几种品系的小鼠和非人灵长类动物模型中具有较好的诱导中和抗体的能力；此外该疫苗可预防急性cvb感染，阻断心脏cvb感染以及预防cvb诱导的胰腺炎和糖尿病。目前该六价cvb疫苗的研究由vactech与provention bio公司继续推动，旨在用于预防急性cvb感染及其并发症，以及潜在的延迟或预防cvb相关的自身免疫性疾病t1d和乳糜泻。

3、尽管随着病毒学和免疫学等相关学科的长足发展，近年来涌现出多种多样的新的疫苗开发技术路线，但受限于对肠道病毒生物学特性及抗原表位的研究和认识还不够深入、充分，相关的疫苗开发仍主要是在全病毒颗粒的基础上进行。已上市使用的肠道病毒相关疫苗（如脊髓灰质炎病毒疫苗、肠道病毒71型疫苗）均采用减毒或灭活等传统疫苗技术开发生产，并且获得了极其显著的免疫保护效果。开发中的产品也以灭活或减毒疫苗为主。此外，相对于减毒活疫苗，灭活疫苗没有毒力返祖及可引发疫苗相关疾病的缺点，具有较好免疫原性和安全性，是目前最为可行、合理的技术路线。cvb4病毒存在遗传多样性，尽管只有一个血清型，但是已经分化为5个基因型。文献报道不同基因型之间存在中和效价的差异。因此，开发对中国cvb4流行株（d和e基因型为优势基因型）具有高效防护作用的cvb4灭活疫苗已势在必行。在传统技术路线的疫苗开发中，筛选在细胞基质内复制能力强、遗传稳定性高，免疫原性和安全性好的毒株作为疫苗生产用毒种至关重要。

4、因此，如何提供一种符合疫苗开发要求的cvb4毒株，并将其应用于制备柯萨奇病毒疫苗是本领域亟需解决的问题。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明提供了一种柯萨奇病毒b组4型毒株，应用于制备柯萨奇病毒b组4型疫苗，具备良好的复制能力、遗传稳定性和免疫原性。

2、本发明采用如下技术方案：

3、一种柯萨奇病毒b组4型毒株，所述毒株的基因组序列如seq id no：1或如seq idno：1所示序列的完全互补序列所示。

4、优选的，所述毒株命名为柯萨奇病毒b 组 4 型 km140-g01coxsackieviru b4cvb4 km140-g01，于2023年6月18日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：v202356，保藏地址为中国.武汉.武汉大学。

5、本发明的另一目的是，提供一种生物材料，为以下任意一种：

6、a .序列如seq id no：1或如seq id no：1所示序列的完全互补序列所示的核酸分子；

7、b.含有a所述核酸分子的表达盒；

8、c.含有a所述核酸分子的重组载体；

9、d.含有a所述核酸分子或b所述表达盒或c所述重组载体的重组微生物；

10、e.含有a所述核酸分子或b所述表达盒或c所述重组载体的细胞系。

11、本发明的另一目的是，提供一种免疫原性组合物，所述免疫原性组合物含有上述的柯萨奇病毒b组4型毒株或含有上述的生物材料。

12、本发明的另一目的是，提供上述柯萨奇病毒b组4型毒株或上述生物材料或上述免疫原性组合物的应用，为以下任意一种：

13、a.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物中的应用；

14、b.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的疫苗中的应用；

15、c.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗体中的应用；

16、d.在制备预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的抗血清中的应用；

17、e.在制备检测柯萨奇病毒的试剂或试剂盒中的应用；

18、.f.在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的免疫原性评价中的应用；

19、g.在非诊断和治疗目的的柯萨奇病毒疫苗的保护性评价中的应用；

20、h.在制备柯萨奇病毒感染细胞模型中的应用；

21、i.在制备柯萨奇病毒感染动物模型中的应用；

22、g.在预防和/或治疗柯萨奇病毒感染或柯萨奇病毒感染引起疾病的药物筛选或药效评价中的应用。

23、本发明的另一目的是，提供一种疫苗，所述疫苗含有上述的柯萨奇病毒b组4型毒株或含有上述的生物材料。

24、本发明的另一目的是，提供述疫苗的制备方法，将上述的柯萨奇病毒b组4型毒株或上述的生物材料在vero细胞上培养，收获病毒液，经灭活和纯化后，加入佐剂配制，得灭活疫苗；

25、或经适应性传代或反向遗传学方法获得毒力弱化的减毒株，经细胞培养，收获病毒液，纯化后加入稳定剂和佐剂配制，得减毒疫苗。

26、有益效果：本发明筛选了一株具有代表性的柯萨奇病毒b组4型毒株km140-g01，该毒株的分离和培养均采用vero细胞，这种细胞基质作为人用疫苗细胞基质是安全可靠的。该毒株增殖能力强、遗传稳定性高、免疫原性好，所属的基因型d为中国两种优势cvb4基因型（d和e）之一，以其为毒种制备的灭活疫苗免疫动物后获得的抗血清对d和e基因型的同源和异源cvb4分离株均具有很高的中和效力。另外，本发明提供了以km140-g01为毒种的灭活疫苗的制备和免疫学评价方法，为开发安全、有效、经济的cvb4灭活疫苗打下了坚实的基础。此外，利用本发明的km140-g01毒株还可以构建稳定且重复性好的柯萨奇病毒b组4型的细胞内增殖模型和急性感染的动物模型，以上模型可为开展cvb4感染致病机制、抗病毒药物筛选和疫苗免疫保护效果评价提供研究工具。