一种水稻抗旱、耐盐基因OsMATE6及其编码蛋白的应用

本发明属于生物，具体涉及水稻osmate6基因及其编码蛋白在提高水稻对抗旱性和耐盐性相关方面的应用。

背景技术：

1、水稻(oryza sativa l.)是重要的粮食作物，我国约60％的人口以稻米为主食。水稻又是高耗水农作物，水稻用水量占我国农业用水总量的65％以上，被称为农业耗水第一大户。伴随全球气候的变化，干旱等极端气候事件频率和强度的增加对水稻的生长发育和产量带来严重威胁。发展节水抗旱水稻，增强水稻的抗旱性，是缓解我国水资源紧张和促进我国农业可持续发展的有效途。另外，由于不合理灌溉导致土壤次生盐渍化极大的制约水稻的生产，并且我国有234万hm2沿海滩涂和1亿hm2内陆盐碱地，是巨大的潜在可利用土地资源。水稻作为中度盐敏感作物被认为是开发沿海滩涂和盐碱地的首选粮食作物。因此，挖掘抗旱耐盐基因，提高水稻对干旱和盐胁迫的抗性，对于促进农业可持续发展和维护国家粮食安全具有重要意义。

2、干旱和高浓度盐都会导致植物产生渗透胁迫和氧化胁迫，另外，高浓度盐还会导致离子毒害等次级胁迫。水稻的抗旱性和耐盐性均是由多基因控制的数量性状，遗传基础较为复杂。在水稻中已克隆数百个与抗旱性相关的qtl(quantitative trait loci，数量性状基因座)或基因，如通过图位克隆技术克隆的dro1基因参与调控干旱胁迫下更深根系的产生进而提高水稻抗旱性。osbzip23通过aba(abscisic acid，脱落酸)依赖的信号通路调控水稻抗旱性。锌指转录因子dst通过调控活性氧清除相关基因表达负调控水稻抗旱性等。目前已有数百个关于水稻耐盐相关qtl的报道，但大多数水稻耐盐qtl的表型贡献率较小，精细定位和克隆难度较大，其中克隆并解析功能的耐盐qtl有skc1，具体定位到一个hkt(high affinity k+transporter，高亲和力k+转运蛋白)家族的编码na+特异性转运蛋白基因oshkt1；5，转录因子osmyb106和ossuvh7通过调控oshkt1；5表达参与对盐胁迫的抗性。

3、多药和有毒化合物排出家族(multidrug and toxic compound extrusion，mate)是一类广泛存在于原核生物和真核生物的次级转运蛋白家族。mate转运蛋白广泛参与植物生长发育的各个过程，已报道mate转运蛋白的功能包括异源物质的外排、次生代谢产物(如生物碱和类黄酮)的积累、铁转运、铝解毒、病原菌抗性和植物激素信号传导等。在水稻中，mate家族共有46个成员，但仅有少数几个基因功能研究的报道，如dg1介导叶源aba向小穗的长距离运输并以温度依赖的方式调控淀粉合成基因表达，进而调控籽粒灌浆。birg1定位于细胞质膜，参与氯离子(cl-)外排，负调控水稻籽粒大小，正调控对盐胁迫的耐受性等。然而，目前关于osmate6基因，尤其在调控抗旱和耐盐相关方面功能的研究和应用尚未见报道。

技术实现思路

1、本发明的一个目的是鉴定参与水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6及其编码蛋白，该基因功能缺失提高水稻对干旱和盐胁迫的抗性。在本领域中，“耐盐性”通常是指植物生长过程中对盐害具有耐受的能力；“抗旱性”通常是指植物生长过程中对干旱造成的水分缺失的适应和抵抗能力。本发明的另一个目的是确定该鉴定的水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6在提高水稻抗旱性和耐盐性的应用，以及提供一种利用该鉴定的水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6培育抗旱、耐盐水稻的方法。本发明对于研究如何提高水稻对干旱和盐胁迫的抗性具有重要参考价值和潜在的应用价值。

2、因此，在第一方面，本发明鉴定了一种水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6，其编码seq id no.2所示的氨基酸序列。

3、在一个优选的方面，所述水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6的核苷酸序列可以选自：

4、1)seq id no.1所示的dna序列；或

5、2)在高严谨条件下可与seq id no.1所示的dna序列杂交的核苷酸序列。

6、在第二方面，本发明提供水稻抗旱、耐盐相关基因osmate6编码的蛋白，所述osmate6蛋白是如下(a)或(b)或(c)的蛋白：

7、(a)由seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白；

8、(b)将seq id no.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和缺失和/或添加且具有与(a)相同活性的由(a)衍生的蛋白质；

9、(c)其它基因编码的与seq id no.2所示的氨基酸序列组成的蛋白具有50％以上的氨基酸同一性并且具有与(a)相同活性的蛋白。

10、其中，seq id no.2由549个氨基酸残基组成。

11、在第三方面，本发明涉及包含如seq id no.1所示的基因或包含编码如seq idno.2所示的多肽的基因的基因敲除载体或基因敲除表达盒在培育具有抗旱性和耐盐性的水稻中的应用。

12、在第四方面，本发明涉及水稻osmate6基因在培育具有抗旱性和耐盐性的水稻中的应用，其中所述基因编码氨基酸序列为seq id no.2的多肽。本发明人发现，在水稻中缺失osmate6基因能够提高水稻抗旱、耐盐的能力。

13、在第五方面，本发明涉及一种培育具有抗旱性和耐盐性的水稻的方法，所述方法包括敲除水稻中的osmate6基因，获得具有抗旱性和耐盐性的转基因水稻，或者利用杂交方法得到osmate6基因功能缺失的后代水稻。

14、在本发明的优选实施方案中，提供一种培育具有抗旱性和耐盐性的水稻的方法，所述方法包括下述步骤：

15、(1)选择编码seq id no.2所示的氨基酸序列的核苷酸序列构建到基因敲除载体中；

16、(2)用步骤(1)中构建好的基因敲除载体(如crispr/cas9载体)转化(如电导、基因枪)水稻的细胞或组织，获得转基因水稻；

17、(3)将获得的转基因水稻进行抗性筛选及转录水平上表达量的鉴定，确定目的基因已被敲除，从而获得转基因敲除水稻。

18、所述转基因水稻为敲除突变体osmate6-1和osmate6-2，其中，osmate6-1在osmate6基因的编码区中对应于seq id no:1的核苷酸序列的第476bp处发生1bp碱基缺失，osmate6-2在osmate6基因的编码区中对应于seq id no:1的核苷酸序列的第458-514bp处发生57bp碱基缺失。

19、在另一个实施方案中，通过将具有osmate6基因功能缺失的水稻与另一水稻杂交，获得具有osmate6基因功能缺失的后代水稻，与未杂交的水稻相比，杂交后代水稻具有更强的抗旱性和耐盐性。例如，与突变体ptm97-1杂交获得osmate6基因功能缺失的后代水稻，与未杂交的水稻相比，所得到的杂交后代水稻具有更强的抗旱性和耐盐性。

20、具体而言，本发明通过下述技术方案解决了本发明的技术问题。

21、1.水稻osmate6基因在培育具有抗旱性和耐盐性的水稻中的应用，其中所述基因编码氨基酸序列为seq id no.2的多肽。

22、2.根据项1所述的应用，其中所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

23、3.包含如seq id no.1所示的基因或包含编码如seq id no.2所示的多肽的基因的基因敲除载体或基因敲除表达盒在培育具有抗旱性和耐盐性的水稻中的应用。

24、4.一种培育具有抗旱性和耐盐性的水稻的方法，包括获得具有osmate6基因功能缺失的水稻，从而培育出与野生型相比抗旱性和耐盐性更强的水稻，所述基因的核苷酸序列如seq id no.1所示。

25、5.根据项4所述的方法，其中所述基因编码氨基酸序列为seq id no.2的多肽。

26、6.根据项4或5所述的方法，其中，获得具有osmate6基因功能缺失的水稻是通过将osmate6基因功能缺失突变体与另一水稻杂交实现的，与未杂交的水稻相比，杂交后代水稻具有更强的抗旱性和耐盐性。

27、7.根据项6所述的方法，其中osmate6基因功能缺失突变体为ptm97-1，所述ptm97-1中osmate6基因的编码区中对应于seq id no:1的核苷酸序列中第1000位鸟嘌呤突变为腺嘌呤，或osmate6基因编码的蛋白质对应于seq id no:2的氨基酸序列中第334位甘氨酸突变为精氨酸。

28、8.根据项4或5所述的方法，其中，获得具有osmate6基因功能缺失的水稻是通过crispr-cas9、锌指核酸酶(zfns)、talens或rnai基因沉默技术对水稻osmate6基因进行敲除获得突变体实现的。

29、9.根据项8所述的方法，其中所述突变体为osmate6-1或osmate6-2，所述osmate6-1在osmate6基因的编码区中对应于seq id no:1的核苷酸序列的第476bp处发生1bp碱基缺失，所述osmate6-2在osmate6基因的编码区中对应于seq id no:1的核苷酸序列的第458-514bp处发生57bp碱基缺失。

30、10.根据项1-3中任一项所述的应用或项4-9中任一项所述的方法，其中所述水稻为龙粳31号或zh11。