LncRNAGm2694在作为小脑相关疾病诊断的标志物中的用途

本发明涉及生物医药，具体涉及lncrna gm2694在作为小脑相关疾病诊断的标志物中的用途。

背景技术：

1、长链非编码rna(long non-coding rna，lncrna)是指序列长度大于200个核苷酸，通常缺乏蛋白质编码功能的rna。lncrna已经在经过基因组水平研究的所有物种中被发现，包括动物、植物、真菌、原核生物，甚至病毒。与mrna不同，lncrna大量定位于细胞核中，部分存在于细胞质中。rna聚合酶ii(polymerase，pol ii)转录产生了大多数的lncrna，因此，lncrna在结构上与mrna相似，具有3’末端多聚腺苷酸尾巴和5’末端m7g帽状结构。长链非编码rna在多种生物学过程中都有重要的作用。其中，lncrna在细胞核中典型的功能是它们对染色质结构和基因组活性的调控。分布在细胞质中的lncrna被认为参与了转录后水平的基因调控。lncrna可以增强或削弱mrna的稳定性，也可以促进或抑制目标mrna的翻译过程。近年来已发现了大量的哺乳动物lncrna，随着对这些lncrna功能与机制研究的不断深入，lncrna已被发现参与胚胎发育、细胞与个体的衰老、疾病的发生与发展等多种生物学过程。

2、迄今为止检测的lncrna中大约有三分之一是灵长类谱系特有的，其中有许多的lncrna在神经系统中表达，这说明lncrna对于大脑高级功能的发展以及神经元细胞的种类和功能的多样性至关重要。在脑组织中特异性表达的lncrna比在其他组织中表达的lncrna相对更加稳定，且在脑组织中特异性表达的lncrna在物种间的保守性相对更强，这表明lncrna在整个哺乳动物谱系的大脑结构的发育中发挥了关键作用。长链非编码rna主要通过以下几种方式在神经系统中发挥功能：(1)lncrna参与神经元的增殖分化。中枢神经系统的发育，基于神经干细胞的分化，形成成熟的中枢神经系统的所有细胞类型，这一过程是由多种细胞高度协调和配合的。在中枢神经系统中，lncrna可以通过调节靶基因的表达来控制细胞的分化，从而调节神经元和神经胶质细胞的数目和种类。(2)lncrna参与突触发生和突触可塑性的调节。在神经系统发育过程中，神经元细胞会延伸出树突和轴突等突起，并形成突触结构，作为神经元之间信号传递的平台。神经元会在外界刺激时调节动作电位的强度和持续时间，这称之为突触可塑性。这些过程对于神经回路的形成至关重要，同样对于学习和记忆等大脑功能也十分重要。lncrna参与突触发生以及突触可塑性调节的功能已被报道。例如，大脑细胞质rna 1(bc1)是在啮齿类动物的大脑中大量表达的lncrna，bc1作为翻译抑制因子，定位于神经元树突，可直接与eif4a和polya结合蛋白(polya-bindingprotein，pabp)相互作用。bc1通常抑制神经元树突中突触后密度蛋白95(postsynapticdensity-95，psd-95)mrna和脆性x阻滞蛋白(fragile x mental retardation protein，fmrp)mrna的翻译，从而参与突触的可塑性调节。(3)lncrna参与神经系统疾病的发生发展。lncrna在中枢神经系统中存在着大量的表达，且参与神经系统的形成与功能维持，lncrna的失调可能会导致神经系统疾病的发生。lncrna目前已被报道参与多种神经系统疾病的病理过程，包括神经胶质瘤、阿尔茨海默病和帕金森病等。因此，对于lncrna在神经系统中的功能和机制研究，可以为我们治疗神经系统疾病提供生物标志物与潜在药物靶点，有助于我们提出更加有效的神经系统疾病诊治方案。

3、小脑(cerebellum，cereb)是中枢神经系统的重要组成部分。小脑不仅与大脑皮层进行密切的信息交流，还与脑干以及脊髓进行传入和传出联系。小脑主要参与躯体平衡和肌紧张的调节，协调随意运动的产生。近年来的研究发现，小脑参与运动相关的学习记忆能力的调控。小脑位于颅后窝，大脑半球的后方，由胚胎早期的菱脑分化而来。小脑既可以横向分为前叶、后叶和绒球小结叶三个部分，也可以纵向分为蚓部、小脑半球的中间部和外侧部。根据小脑的功能分区，可以将小脑为前庭小脑、脊髓小脑和皮层小脑。小脑皮层由三层组成，由内向外依次为颗粒细胞层(granule layer,gl)、浦肯野细胞层(purkinje celllayer,pcl)和分子层(molecular layer,ml)。浦肯野神经元是最早产生的小脑皮质神经元，来源于小脑心室区，浦肯野神经元也是小脑皮层中体积最大的神经元。浦肯野神经元的细胞体呈梭形，整齐且有序地排列在浦肯野细胞层。浦肯野神经元胞体在顶端延伸出2～3条粗长的主树突，在胞体的底端延伸出较为细长的轴突。浦肯野神经元是小脑中唯一与小脑白质进行联系的传出神经元。颗粒神经元是小脑中数目最多的神经元，其在小脑皮层的最内部密集排列，形成颗粒细胞层。颗粒神经元和浦肯野神经元作为小脑皮层中重要的两类神经元，两者在神经元的增殖分化、迁移以及发挥功能的各个过程中，通过突触进行信息传递，相互联系、相互作用。

4、许多lncrna在小脑组织中存在特异性的高表达，以多种方式参与小脑的发育过程。小脑组织中lncrna的表达异常，与小脑共济失调等小脑疾病密切相关。与其他脑区相比，小脑中表达的lncrna的数量相对较高，且这些lncrna的图谱相当独特，这就增加了这些小脑高表达的lncrna可能是小脑功能的重要调节因子的可能性。例如，研究报道脑特异性的lncrna bs-drl1神经元通过与一种重要的染色质相关的非组蛋白hmgb1相互作用，调节dna损伤反应和基因组稳定性，lncrna bs-drl1的缺失会导致小脑皮层浦肯野神经元数目的减少，并伴随小鼠运动和运动协调能力的损伤。尼曼-皮克病(niemann-pick type c，np-c)是一种罕见的、常染色体隐性的神经退行性溶酶体疾病。np-c具有小脑的多种病理特征，包括浦肯野细胞的丢失等，临床表现包括以小脑共济失调、痴呆、吞咽困难、垂直凝视麻痹和胶性猝倒为特征的神经退行性变。通过对np-c疾病模型小鼠的小脑组织进行rna-seq分析，发现np-c疾病模型小鼠有160个lncrna的表达上调和112个lncrna的表达显著下调，说明这些异常表达的lncrna可能会为np-c病的病理过程的机制研究提供新的见解。随着近年来研究的不断深入，越来越多在小脑中特异性表达的lncrna被发现。lncrna在小脑中的功能和机制研究为小脑相关疾病的治疗提供了新的思路。

技术实现思路

1、发明要解决的课题

2、本发明是鉴于上述的现有技术而完成的。其目的在于为了克服现有小脑相关疾病(尤其是针对于小脑浦肯野和颗粒神经元的相关疾病)的诊断技术的不足，提供可以作为小脑相关疾病诊断的标志物的lncrna gm2694。

3、用于解决课题的手段

4、本发明人为了解决上述问题，进行了深入研究，其结果首次发现lncrna gm2694在浦肯野神经元或颗粒神经元的敲除与小脑神经元丢失及突触结构损伤相关，由此首次提出了通过在小脑中检测lncrna gm2694基因的表达量，将其作为小脑相关疾病诊断的标志物，从而对小脑的结构和功能是否正常进行诊断。

5、具体地，本发明涉及以下几个方面：

6、1.检测lncrna gm2694表达的试剂在制备用于诊断小脑相关疾病的诊断剂或试剂盒中的用途。

7、2.根据项1所述的用途，其中检测lncrna gm2694表达的试剂包括lncrna gm2694特异性引物或探针。

8、3.根据项1或2所述的用途，其中所述试剂用于检测lncrna gm2694表达的水平。

9、4.根据项1或2所述的用途，其中所述试剂用于原位检测或rt-qpcr检测lncrnagm2694在小脑组织中的表达。

10、5.根据项4所述的用途，其中所述试剂用于原位检测或rt-qpcr检测lncrnagm2694在小脑神经元的细胞质、突起和/或突触间隙内的表达。

11、6.根据项1或2所述的用途，其中所述小脑相关疾病包括小脑结构和/或功能损伤相关疾病。

12、7.根据项6所述的用途，其中所述小脑相关疾病包括，例如小脑浦肯野神经元和/或颗粒神经元损伤相关疾病。

13、8.根据项6所述的用途，其中所述小脑相关疾病包括神经退行性病。

14、9.根据项6所述的用途，其中所述小脑相关疾病包括小脑共济失调、小脑发育不全、小脑萎缩、小脑发育不良和小脑退化症。

15、10.根据项1或2所述的用途，其中lncrna gm2694特异性引物为gm2694_f：tcgcccgagccttctacttg，gm2694_r：caggggcttctatccactctac。

16、发明效果

17、本发明的lncrnagm2694是总长为52743bp，核苷酸序列来源于ncbi(查询网址：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/100040294)，在小脑中丰富表达的lncrna，lncrnagm2694同源基因(恒河猴loc106995009，人类rp11-491f9.1)在小鼠、恒河猴和人类基因组中的位置是高度保守的。通过检测lncrna gm2694在小鼠不同组织和器官中的表达量，发现lncrna gm2694主要特异性地在小鼠小脑和睾丸组织中富集。在小脑组织中，lncrnagm2694定位于小脑皮层神经元的细胞质、突起和突触间隙，且lncrnagm2694在小脑发育的早期就已经开始表达。通过对浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠和颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠的相关表型进行检测时，发现lncrna gm2694在小脑浦肯野神经元和颗粒神经元中的敲除，导致了小脑相对重量降低、小脑浦肯野神经元和颗粒神经元的丢失、小脑皮层突触结构及稳定性损伤，最终导致小鼠的运动能力以及学习和记忆能力受到损伤。这些结果说明，lncrna gm2694通过影响小脑浦肯野神经元和颗粒神经元的数目以及小脑中突触的稳定性，进而影响了小脑的正常功能。由此可知，lncrna gm2694参与小脑结构和功能的维持，并能作为一种小脑相关疾病诊治的生物标记物，具有潜在的药物研发潜力。

18、附图简单说明

19、图1：通过fish-if实验和rt-qpcr实验对构建的浦肯野神经元或颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠(cko鼠)的敲除效率进行检测。

20、图1a：通过成年小鼠小脑组织冰冻切片及rna-fish实验检测浦肯野神经元或颗粒神经元gm2694 cko鼠小脑组织中gm2694的表达。细胞核使用hoechst 33342(蓝色，如箭头1所示)染色，以hoechst 33342染色信号指示颗粒神经元；浦肯野神经元特异性标志物calbindin(绿色，如箭头2所示)指示浦肯野神经元；gm2694反义链rna探针(红色，如箭头3所示)指示gm2694；gm2694正义链rna探针作为阴性对照。结果显示，浦肯野神经元gm2694cko鼠(pcp2-cre-gm2694-/-)中，lncrna gm2694在小脑浦肯野神经元几乎不表达，但在小脑其他细胞中存在表达；颗粒神经元gm2694 cko鼠(grin2c-cre-gm2694-/-)中，lncrnagm2694在小脑颗粒神经元几乎不表达，但在小脑其他细胞中表达。

21、图1b-1c：通过rt-qpcr实验检测成年浦肯野神经元gm2694 cko鼠和颗粒神经元gm2694 cko鼠小脑组织gm2694的相对表达水平，以gapdh作为内参。grin2c-cre-gm2694-/-、pcp2-cre-gm2694-/-：n＝4；gm2694f/f：n＝7，n表示小鼠只数；采用t检验分析(t-test)，**p＜0.01，***p＜0.001，ns表示统计学无显著差异。

22、图2a：成年浦肯野神经元gm2694 cko鼠、颗粒神经元gm2694 cko鼠和对照组小鼠的代表性免疫荧光染色图像及局部放大图像。其中，细胞核使用hoechst 33342(蓝色，如箭头4所示)染色，颗粒细胞层以hoechst33342染色信号指示颗粒神经元；浦肯野神经元特异性标志物calbindin(绿色，如箭头5所示)指示浦肯野神经元。

23、图2b-e：对浦肯野神经元gm2694 cko鼠、颗粒神经元gm2694 cko鼠小脑皮层浦肯野神经元和颗粒神经元数目的定量统计图。采用t检验分析(t-test)；grin2c-cre-gm2694-/-、pcp2-cre-gm2694-/-：n＝5；gm2694f/f：n＝7，n表示小鼠只数；*p＜0.05，ns表示统计学无显著差异。

24、图3a：浦肯野神经元gm2694 cko鼠、颗粒神经元gm2694 cko鼠和对照组小鼠小脑皮层的代表性透射电子显微镜(transmission electron microscopy,tem)图像，展示小脑皮层突触数目。比例尺为500nm，星号指示突触结构。

25、图3b：展示小脑皮层突触后致密区平均长度(postsynaptic densities,psds)和突触囊泡数目(synaptic vesicles,svs)。比例尺为200nm，箭头指示突触连接处。

26、图3c-h：展示浦肯野神经元或颗粒神经元gm2694 cko鼠小脑皮层突触数目、突触囊泡数目、突触后致密区平均长度定量统计。采用t检验分析(t-test)；grin2c-cre-gm2694-/-：n＝43；pcp2-cre-gm2694-/-：n＝37；gm2694f/f：n＝29，n表示视野数；*p＜0.05，****p＜0.0001，ns表示统计学无显著差异。

27、图4a-b：通过小鼠转棒实验和小鼠新物体识别实验检测小鼠运动能力和学习记忆能力。

28、图4c-d：浦肯野神经元gm2694 cko鼠或颗粒神经元gm2694 cko鼠在转棒仪上停留的时间。

29、图4e-f：浦肯野神经元gm2694 cko鼠或颗粒神经元gm2694 cko鼠相对于对照组小鼠的认知指数。采用t检验分析(t-test)；grin2c-cre-gm2694-/-、pcp2-cre-gm2694-/-：n＝5；gm2694f/f：n＝5，n表示小鼠只数；*p＜0.05，**p＜0.01，ns表示统计学无显著差异。

30、发明的具体实施方式

31、为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。

32、下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用的试剂如无特别说明均为可商购的试剂。

33、下述实施例中lncrna gm2694的引物序列如表1所示，表中lncrna gm2694引物序列和gapdh(内参)引物序列是由通用生物(安徽)公司合成的。

34、表1：lncrna gm2694的碱基序列

35、

36、用于检测lncrna gm2694的表达量的荧光原位杂交实验(fish)或rt-qpcr实验的具体步骤如下所述。

37、荧光原位杂交实验(fish)

38、1、提前从-80℃冰箱取出目标脑片，在普通显微镜下观察筛选，避免使用有破损的脑片，室温放置2h，自然晾干；

39、2、4％ pfa(rnase-free)室温固定10～15min；

40、3、1×pbs缓冲液洗三次，每次5min；

41、4、1μg/ml蛋白酶k(thermo scientific，eo0491)缓冲液室温消化20min；

42、5、使用4％ pfa室温固定5min.，增加组织稳定性；

43、6、1×pbs缓冲液洗涤2次，每次5min；

44、7、乙酰化溶液室温孵育10min，减少非特异性结合。乙酰化溶液(20ml体系：depc水19.65ml、三乙醇胺266.65μl、浓盐酸35μl和乙酸酐50μl)；

45、8、1×pbs缓冲液洗涤2次，每次5min；

46、9、准备预杂交液：50％甲酰胺(formamide)、5×ssc和0.3mg/ml trna(invitrogen，am7119)；

47、10、使用预杂交液室温孵育4～6h；

48、11、准备杂交液：向预杂交液中加入200ng/ml rna探针(rna探针需变性，95℃，10min，之后立即放在冰上5min)；

49、12、缓慢从切片中移去预杂交缓冲液；

50、13、加入杂交液，置于70℃杂交炉中12～14h；

51、14、使用5×ssc洗涤2次，每次5min，置于70℃杂交炉中，洗涤的温度与杂交的温度要一致；

52、15、1×pbs缓冲液洗2次，每次5min；

53、16、3％ bsa(biofroxx，9048-46-8)室温封闭1h；

54、17、敷一抗(anti-biotin 555antibody，thermo fisher scientific，s21381)室温静置1h，1:500稀释抗体；

55、18、1×pbs缓冲液洗3次，每次5min；

56、19、滴加hoechst 33342(sigma-aldrich，875756-97-1，1:2000稀释)室温孵育2-3min；

57、20、1×pbs缓冲液洗3次，每次5min；

58、21、加入5μl抗淬灭剂(prolongtm gold antifade reagent)，盖玻片倾斜45°缓慢盖上，避免在目标组织附近产生

59、气泡，盖玻片四周用指甲油封片；

60、22、4℃冰箱保存，静置几小时后观察效果更佳。

61、rt-qpcr实验

62、rna提取步骤：

63、1、先提前在离心管内加入300μl trizoltm试剂，取适量组织(50-100mg)在1×pbs缓冲液中清洗干净后加入离心管，使用电动匀浆器在冰上间断性匀浆2min至所取组织无颗粒状沉淀。匀浆时间可适当延长。匀浆后补加700μl trizoltm，吹打混匀；

64、2、将组织匀浆液在通风橱内放置5min，进行下一步rna抽提前进行充分裂解；

65、3、水相分离：向裂解后的组织匀浆液中加入0.2ml氯仿(对应1ml trizol)，剧烈震荡离心管15s后在室温下放置2min。将离心管放入提前预冷的离心机，12000g，4℃，离心10min。准备新的rnase-free离心管，将离心后含有rna的上层水相转移，每次吸取200μl，注意一定不能吸取到中间层；

66、4、向400μl上层水相加入400μl异丙醇，上下颠倒混匀，室温放置10min；

67、5、12000g，4℃，离心10min，离心后可在离心管管底观察到白色沉淀。弃上清，尽可能把异丙醇去除干净；

68、6、加入1ml 75％酒精(depc水进行配制)洗涤沉淀，缓慢颠倒几次，让rna沉淀充分接触酒精洗涤液。8000g，4℃，离心5min，弃上清后立即打开离心管并放在冰上干燥5s；

69、7、根据沉淀大小加入无核酸酶水(depc水)，充分溶解rna；

70、8、使用nano-300进行rna浓度测定，a260/a280的比值～2视为高纯度。将rna样品的浓度和纯度信息记录在离心管的侧壁，并将样品在-80℃冰箱保存或立即进行后续实验；

71、9、rna质量鉴定：配制普通的1％琼脂糖凝胶，对rna样品进行凝胶电泳，28s:18s核糖体rna的亮度比应为2:1，可见少量的5s条带。

72、rna反转录步骤：

73、根据反转录试剂盒(ii 1st strand cdna synthesis kit，vazyme)，按照试剂盒说明书进行操作。

74、(1)基因组dna去除：在rnase-free离心管中配制如下混合液，

75、

76、用移液枪轻轻吹打混匀，42℃，孵育2min。

77、(2)配制第一链cdna合成反应液，

78、

79、用移液器轻轻吹打混匀。

80、(3)按下列条件进行第一链cdna合成反应，

81、

82、产物可立即进行后续实验，或在-20℃冰箱暂存。若将产物长期存放则应按实验需求分装后在-80℃冰箱保存。

83、实时荧光定量pcr步骤：

84、根据诺唯赞公司提供的实时荧光定量pcr试剂盒说明书进行操作。

85、

86、qpcr反应程序如下表所示：

87、

88、实施例1：lncrnagm2694对小脑浦肯野神经元和颗粒神经元数目的影响

89、利用cre-loxp位点特异性重组酶系统，构建浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠和颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠。在该cre-loxp位点特异性重组酶系统中flox小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，pcp2 cre酶和grin2c cre酶工具小鼠购买自成都兰博生物科技有限公司。

90、首先用冰冻切片机(leica，cm1950)将小鼠小脑组织切成10mm厚度的切片，之后进行if实验。该if实验的具体步骤如下所述。

91、1、实验前先取出组织切片，室温晾干；

92、2、1×pbs缓冲液洗三次，每次5min；

93、3、使用0.1％ triton x-100(sigma，9002-93-1)，室温进行穿膜45min；

94、4、采用3％ bsa(biofroxx，9048-46-8)溶液进行室温封闭1h；

95、5、加入抗体(一抗，anti-calbindin-d28k antibody，proteintech，66394-1-ig)，放置4℃冰箱孵育过夜；

96、6、1×pbs洗三次，每次5min；

97、7、加入荧光抗体(二抗，invitrogentm streptavidin,alexa fluortm488conjugate，thermo fisher scientific，s11223)，室温孵育1～2h，进行避光操作；

98、8、使用hoechst 33342(sigma-aldrich，875756-97-1)细胞核染色2～3min；

99、9、1×pbs缓冲液洗3次，每次5min；

100、10、加10μl抗淬灭剂(prolongtm gold antifade reagent)进行封片，并在盖玻片四周涂抹指甲油。既可用于显微镜观察。

101、进行if实验之后，对小脑组织中的浦肯野神经元和颗粒神经元数目进行统计。

102、如图2结果所示，在浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠中，小脑中浦肯野神经元的数目与对照组相比显著减少，小脑中颗粒神经元的数目与对照组相比也有减少的趋势；在颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠中，浦肯野神经元和颗粒神经元的数目变化呈现出与浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠相同的减少趋势。

103、实施例2：lncrnagm2694对小脑突触结构和稳定性的影响

104、通过透射电子显微镜，对小脑皮层突触数目、突触囊泡数目和突触后致密区平均长度进行观察和统计。

105、如图3结果所示，在浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠中，与对照组小鼠相比，小脑皮层中突触的数目、单个突触结构中突触囊泡(svs)的数目、突触后致密区的平均长度(psds)均显著降低；在颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠中，与对照组小鼠相比，小脑皮层中突触的数目、单个突触结构中突触囊泡、突触后致密区的平均长度变化呈现出与浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠相同的下降趋势。

106、这一结果表明，lncrnagm2694在浦肯野神经元或颗粒神经元中的特异性敲除不仅会导致小脑皮层中单个突触的结构受到损伤，同时也会对小脑皮层中整体的突触数量以及稳定性造成影响。

107、实施例3：lncrnagm2694对小脑功能的影响

108、对小鼠进行转棒实验，该转棒实验的具体步骤如下所述。

109、1、打开电脑，找到桌面上的rota rod软件(仪器型号：上海欣欣，xr1514)，再打开仪器(注意断开电脑网络)。

110、2、rota rod软件程序操作：

111、(1)模式选择和确认；

112、(2)实验设置包括三项：连接、基本配置和速度配置；

113、1)设备连接，然后点击连接和确认，勾选出1-6通道(左到右)；

114、2)速度配置，载入后选择速度配置(可以自己手动输入)如：

115、

116、3、连接设备，勾选1-6通道，然后启动电机约2s后立即点击同步启动通道；记录数据(提前打印成表格，备注好实验日期)。

117、每天实验需重复3次，记录trial 1、trial 2、trial 3

118、

119、对小鼠进行新物体识别实验，该新物体识别实验的具体步骤如下所述。

120、1、搭建新物体识别装置：装置包括方形的黑色盒子(40cm×40cm×30cm)，摄像装备，动物行为分析软件(the any-maze video-tracking system，stoelting，wood dale，usa)，乐高积木(组装成三个物体，其中两个物体是相同的，另外一个物体在颜色和形状上与另外两个物体都不相同)。

121、2、实验过程：

122、(1)提前将实验小鼠放在行为学平台的饲养间适应一周；

123、(2)在进行实验前2h，将小鼠放在新物体识别装置周围，适应实验环境；

124、(3)将两个相同的积木放在黑盒子一侧，左右各一个，轻柔地抓住小鼠尾巴将其放入训练场地中间，使训练小鼠距两物体的距离相同。将小鼠放入装置中适应10min后，启动录像设备，录制小鼠探索新物体的全过程。实验人员需要远离实验设备，避免造成干扰。小鼠在场地中自由探索两个相同的物体3min；

125、(4)第二天正式实验，将小鼠相对探索时间少的一侧物体替换成一个新的物体(形状和颜色均不同)，小鼠自由探索两个物体3min，录制小鼠探索新物体的全过程。(每次实验间隔必须使用75％乙醇擦拭实验装置，消除小鼠异味)；

126、(5)实验结束将实验小鼠送回行为学平台饲养间；

127、(6)利用动物行为分析软件，计算小鼠认知指数(discrimination index)，该指数反应小鼠对新物体的偏好性，进而检测小鼠的认知能力。

128、如图4c-d结果所示，与对照组相比，浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠在转棒仪上跑动的时间、距离和速度都显著减少；与对照组相比，颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠在转棒仪上跑动的时间、距离和速度也呈现出减少的趋势。这一结果表明，浦肯野神经元gm2694条件性敲除鼠和颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠的运动能力以及运动协调能力受损。

129、并且，如图4e-f结果所示，与对照组相比，颗粒神经元gm2694条件性敲除鼠的认知能力也受到了一定程度损伤。这一结果表明，lncrna gm2694在浦肯野神经元或颗粒神经元中的特异性敲除会造成小脑中的神经元和突触损伤，进而导致小脑的功能也受到一定程度的影响。

130、以上结果说明，lncrna gm2694通过影响浦肯野神经元和颗粒神经元数目以及小脑皮层突触稳定性，参与小脑结构和功能调控。因此，通过检测lncrna gm2694在小脑组织中的表达量，并将其作为小脑相关疾病诊断的标志物，可以有效对小脑结构和功能是否正常进行诊断。

131、以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。