用于抑制PCSK9基因表达的siRNA及其递送系统的制作方法

本发明属于生物医药，涉及一种用于抑制pcsk9基因表达的sirna及其递送系统。

背景技术：

1、前蛋白转化酶枯草杆菌素/kexin9型(proprotein convertase subtilisin/kexin type9，pcsk9)，是近年来在降脂药开发领域研究的一个新兴靶点，主要来源于人体肝脏细胞，在小肠、肾间质细胞及神经元也有表达。pcsk9不仅与常染色体显性遗传高胆固醇血症相关，还能够有效调节体内脂质代谢水平，影响冠心病的发生发展。除此之外，一些研究指出pcsk9在炎症、肿瘤的发生发展中也发挥了重要作用。

2、近年来，pcsk9抑制剂成为一个治疗高胆固醇血症及动脉粥样硬化性心血管疾病(ascvd)药物研发的新热点。目前已上市销售的pcsk9抑制剂仅有3款，分别是安进的依洛尤单抗、赛诺菲的阿利西尤单抗以及诺华的inclisiran。依洛尤单抗和阿利西尤单抗均是通过与ldl-r竞争结合pcsk9，抑制ldl-r的内吞、降解，增加肝细胞膜上与ldl-c结合的ldl-r数量，促进肝脏对ldl-c的代谢，最终降低血浆ldl-c水平，这两款均为两周一次或加大剂量一个月一次皮下注射。inclisiran是一种化学合成的sirna，可以抑制pcsk9基因的表达过程。inclisiran与肝细胞表面表达的脱唾液酸糖蛋白(asgpr)特异性结合后进入肝细胞内作用于pcsk9的mrna，阻止pcsk9的翻译过程，一年只需要两次皮下注射，而单抗则需每2-6周给药一次。

3、中国专利申请cn110638788a公开了一种能够沉默pcsk9蛋白的sirna，其正义链核苷酸序列为5’-uuccgaauaaacuccaggcdtdt-3’，反义链核苷酸序列为5’-gccuggaguuuauucggaadtdt-3’。

4、目前pcsk9抑制剂的抑制效率通常在60％以下，在应用于重度高脂血症或炎症、肿瘤等适应症时可能面临药效不佳的处境，pcsk9抑制剂的抑制效率有待进一步提高。

技术实现思路

1、本发明的第一个目的在于提供一种用于抑制pcsk9基因表达的sirna，以解决上述技术问题中的至少一个。

2、本发明的第二个目的在于提供一种递送系统，可用于递送上述sirna，以解决上述技术问题中的至少一个。

3、本发明的第三个目的在于提供上述递送系统的制备方法，以解决上述技术问题中的至少一个。

4、本发明的第四个目的在于提供一种包含上述递送系统和药学上可接受的一种或多种辅料的药物组合物。

5、根据本发明的一个方面，提供了一种用于抑制pcsk9基因表达的sirna(下称为“sipcsk9(mut-1)”)，其具有正义链和反义链，其中，正义链的核苷酸序列包括经修饰的或未经修饰的如seq id no:3所示的核苷酸序列；反义链的核苷酸序列包括经修饰的或未经修饰的如seq id no:4所示的核苷酸序列。

6、本技术以genbank数据库中pcsk9基因的序列(gene id：255738，ng_009061.1)为基础，设计得到沉默效率高于inclisiran、正义链的核苷酸序列包括经修饰的或未经修饰的如seq id no:1所示的核苷酸序列、反义链的核苷酸序列包括经修饰的或未经修饰的如seq id no:2所示的核苷酸序列的靶向pcsk9基因的sirna(下称为“sipcsk9(original)”)，并进一步对sipcsk9(original)进行特定位点的错配，得到一系列突变序列，通过大量的试验验证和筛选，最终获得一种pcsk9基因沉默效率显著提高的sirna，即sipcsk9(mut-1)。

7、在一些实施方式中，核苷酸序列的修饰可以包括在正义链和/或反义链的3’端悬垂脱氧核糖核苷酸dtdt；若无dtdt悬垂，该位置可被核糖核苷酸uu所取代。

8、在一些实施方式中，核苷酸序列的修饰还可以包括对核苷酸进行氟取代修饰、甲氧基修饰或硫代骨架修饰。

9、在一些实施方式中，当正义链和反义链的3’端悬垂脱氧核糖核苷酸dtdt时，硫代骨架修饰可以包括：按照5’端至3’端的方向，将以下位置的p＝o键替代为p＝s键：正义链第20、21位核苷酸之间的p＝o键；反义链第20、21位核苷酸之间的p＝o键。

10、在一些实施方式中，核苷酸序列的修饰可以包括：按照5’端至3’端的方向，在位于以下位置的核苷酸糖环的2’位置进行甲氧基修饰：正义链第2、3、4、9、10、11、13、14、15位；反义链第8、15位。

11、在一些实施方式中，经修饰后的sipcsk9(mut-1)序列可以为：

12、正义链：

13、5’-gcmcmumggagumumumaumumcmggaudtsdt-3’；

14、反义链：

15、5’-auccgaaumaaacuccmaggcdtsdt-3’。

16、在一些实施方式中，为进一步提高sirna在细胞内的稳定性，硫代骨架修饰可以包括：按照5’端至3’端的方向，将以下位置的p＝o键替代为p＝s键：

17、正义链第1、2位核苷酸之间的p＝o键，第2、3位核苷酸之间的p＝o键；

18、反义链第1、2位核苷酸之间的p＝o键，第2、3位核苷酸之间的p＝o键，第19、20位核苷酸之间的p＝o键，第20、21位核苷酸之间的p＝o键。

19、在一些实施方式中，为进一步提高sirna的稳定性，加强rna诱导沉默复合体对反义链的识别并降低脱靶率，核苷酸序列的修饰可以包括：按照5’端至3’端的方向，在位于以下位置的核苷酸糖环的2’位置进行氟代修饰：正义链第5、7、8、9位，反义链第2、6、8、9、14、16位；在其余位置的核苷酸糖环的2’位置进行甲氧基修饰。

20、在一些实施方式中，sipcsk9(mut-1)经修饰后的序列可以为：

21、正义链：

22、5’-gmscmscmumgfgmafgfufumumamumumcmgmgmamum-3’；

23、反义链：

24、5’-amsufscmcmgmafamufafamamcmumcfcmafgmgmcmsumsum-3’。

25、经上述修饰得到的sipcsk9(mut-1)，其对pcsk9 mrna的沉默效率显著提高。

26、根据本发明的第二个方面，提供了一种用于递送sirna的递送系统，包括sirna和脂质成分，脂质成分与sirna的质量比为(8～12):1；脂质成分的组成包括dotap(cas:132172-61-3，(2,3-dioleoyloxy-propyl)-trimethylammonium-chloride)、dlin-mc3-dma(cas:1224606-06-7，(6z,9z,28z,31z)-heptatriaconta-6,9,28,31-tetraen-19-yl4-(dimethylamino)butanoate)、dspc(二硬脂酰磷脂酰胆碱，cas:816-94-4)、半乳糖脑苷脂、胆固醇和peg脂质。

27、qtsome是一种四价(quaternary)和三价(tertiary)阳离子磷脂共存的脂质纳米粒，该递送系统具有高负载、高稳定性的特点，可保护sirna免受体内酶系统的降解，进入细胞后高效从内吞体中逃逸。本发明通过将qtsome脂质成分中一定比例的胆固醇替换为半乳糖脑苷脂，显著提高了sirna的沉默效率。

28、在一些实施方式中，dotap、dlin-mc3-dma、dspc、半乳糖脑苷脂、胆固醇和peg脂质的摩尔比可以为(1～15)：(40～65)：(5～15)：(1～20)：(20～50)：(0.5～5)。

29、在一些实施方式中，peg脂质可以选自dsg-peg、dmg-peg中的至少一种。

30、在一些实施方式中，sirna可以为本发明提供的sipcsk9(mut-1)。由此，制得的用于递送sipcsk9(mut-1)的递送系统，递送效率显著提高，对pcsk9 mrna的沉默效率可提高至85％以上。

31、根据本发明的第三个方面，提供了一种制备上述递送系统的方法，包括如下步骤：

32、取sirna用缓冲液配制成sirna缓冲液；

33、取脂质成分用无水乙醇配制成脂质乙醇溶液；

34、取脂质乙醇溶液和sirna缓冲液按脂质成分与sirna的质量比为(8～12):1混合，除去乙醇、稀释并调节ph为6.8～7.2，即得。

35、在一些实施方式中，可以用ph＝5.0的醋酸钠缓冲液将sirna配制成sirna缓冲液。

36、在一些实施方式中，sirna缓冲液和脂质乙醇溶液在混合前，可以先预热至25℃。

37、在一些实施方式中，可以用截留分子量为100kd的超滤管2000g(离心力)超滤除去乙醇。

38、根据本发明的第四个方面，提供了一种药物组合物，包含本发明提供的用于递送sipcsk9(mut-1)的递送系统和药学上可接受的一种或多种辅料。

39、利用本发明提供的递送系统递送的sipcsk9(mut-1)对小鼠肝脏pcsk9mrna的沉默效率达到约85％，因此，本发明提供的用于递送sipcsk9(mut-1)的递送系统可作为pcsk9抑制剂，与药学上可接受的一种或多种辅料制成药物，应用于治疗高胆固醇血症、动脉粥样硬化性心血管疾病、重度高脂血症、炎症、自身免疫性疾病、脓毒症、肿瘤等与pcsk9基因表达相关的适应症。

40、在一些实施方式中，可以通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤等途径施用本发明的药物组合物。

41、在一些实施方式中，药物组合物可以制备成片剂、注射液、冻干粉、栓剂等任意药学上可通过口服、静脉内、腹膜内、皮下或经皮肤等途径施用的剂型。