一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法与流程

本发明属于生物技术及组学分析领域，具体地，涉及一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、微生物是地球上最为丰富的生物资源，在土壤、植物生长发育、食品发酵和人类活动等方面发挥着重要作用，它们推动着全球元素循环、生态环境治理、生物制药和疾病诊断及预防等方向的发展，影响着人类的免疫、消化及心理健康等方面。

2、随着二代测序技术的发展，对微生物群落多样性及进化的研究和认知已经大大提高，然而，微生物群落的准确表征一直是一个具有挑战性的问题，基于16s rrna、18s rrna和its基因的扩增子测序是微生物生态学中测量特定微生物群落结构和特征分布的常用工具。

3、通过提取样品中的dna，对16s或its基因区域进行pcr扩增，通过构建文库，基于illumina、pacbio等测序平台测序，然后结合生物信息学方法进行序列分析和物种注释，可以了解样品的群落组成情况，进一步通过alpha和beta多样性分析可以进一步比较样品之间的差异性。相较于二代测序只选择1-2个高变区进行测序，三代测序可以获得全长的16s或its序列，更多变异区信息可以提高物种鉴定的分辨率，还可以提高对于群落组成的鉴定精度，更加真实的还原样本中微生物群落结构。扩增子测序方法对研究水体、土壤、空气和肠道粪便等环境中的微生物群落组成分析有重要的指导作用，同时也是系统发育和生态学研究中广泛使用的方法。

4、常规扩增子测序技术虽然其具有高通量，低花费，可客观还原菌群结构及相对丰度比例的巨大优势，但目前大部分的扩增子测序技术由于技术的限制，仅产生相对丰度的数据，只能描述某个物种占整个环境样本中的百分比，无法表示这个物种在环境群落中的绝对含量，会导致otu分析中的高假阳性率和相关分析偏差，无法体现样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异微生物群落的绝对丰度变化，这是扩增子测序技术所面临的重要问题。例如，物种s在样本a和样本b中分别占有10%和20%的比例，当样本a、b微生物总量一致时，a样本中的物种s绝对丰度高于b样本；若a样本(109cells/g)中微生物总量少于b样本(1010cells/g)时，a样本中的物种s绝对丰度则低于b样本。

5、因此，实现矫正扩增子测序偏差，较为精准的确定微生物种群丰度，增加样品间可比性，进一步真实反映样本中物种的真实数量和组间样本的真实差异，使测序结果更为准确可信，以弥补常规扩增子测序技术方法的不足，对于全面研究与了解环境微生物群落结构及其分类学具有十分重要的意义。

技术实现思路

1、针对目前所存在的技术问题，本发明提供了一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物、试剂盒及方法。

2、为了达到上述目的，本发明采用如下技术手段：

3、本发明的第一方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量的内参组合物，所述内参组合物包括如seq id no.1-seq id no.8所示的8条内参序列。

4、进一步地，所述内参组合物中seq id no.1-seq id no.8具有由低到高的浓度梯度，且内参组合物与样本的占比为10%-30%，在一些具体实施方案中，所述内参组合物中seqid no.1-seq id no.8浓度梯度比例为1：3：6：15：30：60：150：300。内参dna序列的设计需要包含原核生物通用引物结合位点、与体内靶标长度和gc含量相同的优化合成填充序列以及一个易于获取和处理的克隆载体，所设计的序列通过ncbi验证，与自然界已知的自然物种序列无匹配关系。

5、进一步地，还包括由正向引物seq id no.9和反向引物seq id no.11；正向引物seq id no.11和反向引物seq id no.12；正向引物seq id no.13和反向引物seq idno.14；正向引物seq id no.15和反向引物seq id no.16组成的4对引物对中的一对。在一些具体实施方案中，所述引物对兼容16s及its扩增区域，引物名称与引物序列的对应关系为：its3-f对应序列seq id no.9；its4-r对应序列seq id no.10；27f对应序列seq idno.11；1492r对应序列seq id no.12；its1f对应序列seq id no.13；its4r对应序列seq idno.14；338f对应序列seq id no.15；806r对应序列seq id no.16。

6、在一些具体实施方案中，采用27f对应序列seq id no.11为正向引物；1492r对应序列seq id no.12为反向引物，进行16s全长扩增。

7、本发明的第二方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量试剂盒，所述试剂盒包括前文所述的内参组合物。

8、本发明的第三方面提供了一种微生物种群绝对丰度定量方法，包括如下步骤：

9、s1.按照权利要求1所述的内参序列合成内参dna；

10、s2.样本dna提取：

11、s3.将满足权利要求2的内参组合物添加到样本dna中，添加权利要求3所述的引物对，混合均匀后进行pcr扩增，获得pcr产物；在一些具体实施方案中，s3包括利用带不同barcode的引物进行扩增，得到不同pcr扩增产物，barcode为在正向引物和反向引物的前面增加的几个不同的碱基，作为barcode标签，用来标记和区分不同的pcr扩增产物；

12、s4.构建文库及上机测序：对s3扩增后的pcr产物进行纯化后进行文库构建并测序；在一些具体实施方案中，s4包括对得到的不同pcr扩增产物进行浓度比对，并按照等量原则将各pcr产物混合后进行纯化。建库文库要求每个pcr产物的总量相同、片段相近，根据测定的浓度，对每个pcr产物取体积混合。

13、s5.下机数据质控；在一些具体实施方案中，采用二代测序，下机数据质控包括去除接头序列、低质量及重复序列等，得到高质量测序数据；在一些具体实施方案中，采用三代测序，下机数据质控包括序列校正、去除低质量及短序列，得到高质量测序数据。

14、s6.构建标准曲线：对质控合格的下机数据通过比对内参序列数据库，输出内参dna的otu表后，基于内参dna的拷贝数和下机测序的内参序列reads数据，构建内参dna拷贝数和reads数间的标准曲线；

15、s7.定量结果输出。

16、进一步地，s1还包括如下步骤：对合成的内参dna进行浓度测定，准确计算内参dna拷贝数。

17、进一步地，s6还包括拷贝数校正步骤：根据构建的标准曲线，对样本菌群的拷贝数做进一步校正，计算样本中各菌群的绝对拷贝数。

18、进一步地，s6后还包括如下步骤：对质控合格的下机数据，过滤内参序列，得到高质量的非内参有效序列用于物种分析。

19、在一些具体实施方案中，样本类型为土壤、水体、酒糟、酒醅、窖泥、粪便等；样本dna提取采用行业内已知的提取方法，根据不同类型的样本选择合适的dna提取方法，以提高dna浓度和总量。

20、在一些具体实施方案中，得到高质量的非内参有效序列用于otu丰度分析，otu聚类分析，物种注释分析以及统计分析等。

21、与现有技术相比，本发明的有益效果：

22、1、本发明方法适用范围广，可覆盖不同类型的样本，并可以选择结合二代测序和三代测序不同的测序方法的优势，对样本中不同菌群的含量进行准确定量。

23、2、本发明方法通过向环境样本中添加不同浓度梯度的内参dna，可以量化不同微生物群落间的绝对含量；在pcr反应过程中，内参dna分子会产生预期大小的扩增子，结合内参dna的拷贝数和测序输出的reads数，建立内参dna拷贝数（log拷贝数）和reads（logreads）间的标准曲线，便可进一步计算出样本中各菌群拷贝数的绝对丰度，可以准确估算单位样品中物种的绝对丰度。

24、3、本发明方法通过构建内参系统，可以使操作步骤中待测样品与内参系统所经历的处理条件一致，使两者扩增效率尽可能的接近，从而实现绝对定量。

25、4、本发明方法可以避免因样本中不同微生物浓度之间可能存在的差异而造成的扩增过程中的速率差异，从而确保了计算结果更为准确。

26、5、本发明的方法一次扩增实验，可以同时得到相对定量和绝对定量结果两份分析结果，节省样品与内参dna用量，最大程度上节省测序成本。