一种超灵敏数字化免疫传感方法

本发明属于分析传感领域，主要涉及一种超灵敏数字化免疫传感方法。

背景技术：

1、复杂介质中蛋白质的超灵敏检测对于医学诊断、生物标志物发现和药物研发等至关重要。例如，在神经源性疾病中，如帕金森病（pd）和阿尔茨海默病（ad），蛋白的生物标志物由于血脑屏障的存在而以极低的水平存在于外周血中。使用如酶联免疫吸附测定（elisa）或化学发光等传统分析方法定量检测这些生物标志物是具有挑战性的。因此，目前pd和ad在临床诊断上仍依赖于医学成像和病理分析，而不是分子图谱。近年来，超灵敏的免疫传感取得了快速发展，有代表性的如单分子免疫传感技术和超灵敏电化学发光等。其中，数字免疫传感在超高灵敏度（如亚飞摩尔检测）方面引起了越来越多的关注。原则上，数字免疫传感依赖于将目标混合物随机划分为大量微孔或微滴后对阳性信号进行统计分析（如泊松分布）。目前，数字免疫传感器已应用于癌症的早期筛查、低丰度蛋白生物标记物的检测和发现以及其他医学诊断等。

2、目前，大多数字免疫传感器面临的一个主要挑战是使用基于微芯片平台，这会导致两个问题：第一个问题是微纳结构芯片制造成本高昂；第二个问题是微流体泵的使用，导致其在临床环境中很难被广泛应用。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的不足，本发明的目的是提供一种超灵敏数字化免疫传感方法，将免疫pcr和微滴发生装置相结合，实现对低丰度的目标蛋白分子的精确检测。

2、本发明实现发明目的的技术方案如下：

3、一种超灵敏数字化免疫传感方法，磁颗粒与初级抗体偶联；次级抗体利用单链信号dna修饰；所述的初级抗体、次级抗体分别识别目标蛋白形成三明治结构的磁颗粒免疫复合物；

4、分离除去磁颗粒，得到游离的三明治结构的免疫复合物；通过液滴发生器将游离的三明治结构的免疫复合物加载到油包水（w/o）微滴中；

5、扩增单链信号dna，产生荧光微滴；计数荧光微滴从而得到目标蛋白的含量。

6、所述的磁颗粒为金包磁纳米颗粒（au@mnps）。

7、所述的磁颗粒与初级抗体偶联使用两端分别带不同基团的双链链接dna，磁颗粒与双链链接dna之间形成金硫共价键，初级抗体和双链链接dna之间形成酰胺键。

8、所述的单链信号dna修饰的次级抗体使用生物素和链霉亲和素之间的相互共价结合。

9、所述的双链链接dna使用限制性核酸内切酶特异性酶切的方法处理，释放三明治结构的免疫复合物。

10、所述的方法，通过液滴发生器将游离免疫复合物加载到油包水（w/o）微滴中，所述的液滴发生器类型包括离心式、微流控芯片式或振荡式。

11、所述的单链信号dna扩增包括实时荧光定量pcr、环介导的等温扩增；dna扩增染料包括双链dna结合染料或分子探针。

12、所述的目标蛋白的来源包括动物、植物、微生物，或者人工产物。

13、所述的目标蛋白的来源为未经处理或者预处理后的人的体液，包括血清、尿液、脑脊液，或唾液。

14、所述的方法，步骤如下：

15、１）初级抗体使用双链链接dna与金包磁纳米颗粒偶联，捕获目标蛋白；

16、２）次级抗体用单链信号dna修饰，识别目标蛋白，形成金包磁纳米颗粒-三明治结构的免疫复合物；

17、３）使用限制性核酸内切酶特异性酶切双链链接dna，释放三明治结构的免疫复合物；

18、４）使用微滴发生器将游离的免疫复合物加载入微滴中，使得每个微滴中有且仅有一个三明治结构的免疫复合物；

19、５）对微滴进行数字pcr扩增产生荧光信号；

20、6）对荧光微滴和总微滴进行计数，从而得到目标蛋白的浓度或含量。

21、本发明的有益效果：

22、本发明将免疫pcr应用于微滴发生装置，实现了am蛋白分子水平，甚至单分子水平的蛋白免疫检测。

23、所述的免疫传感方法减少了因au@mnps等固相载体引起的非特异性吸附；只有在连接和信号两部分同时存在时，数字化免疫传感才可以正常进行，进一步提高了该免疫传的特异性。

24、所述的免疫传感方法对双链核酸上的特异性位点酶切使得金包磁纳米颗粒和免疫复合物分离，这部分的双链核酸可以使用例如可控光化学响应等材料替换，更快更高效的释放免疫复合物。

25、所述的免疫传感方法可使用聚合酶链式反应的方法生成检测信号，核酸自身的多样性为蛋白的联检提供了更多的可能。

26、该免疫传感方法具有操作简单、成本低、适用性广、灵敏度高和特异性强等优势，可应用于多个领域，多个物种，尤其是对于体外诊断、筛查、生物标志物的发现等应用具有较高的价值。

技术特征：

1.一种超灵敏数字化免疫传感方法，其特征在于：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磁颗粒为金包磁纳米颗粒（au@mnps）。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的磁颗粒与初级抗体偶联使用两端分别带不同基团的双链链接dna，磁颗粒与双链链接dna之间形成金硫共价键，初级抗体和双链链接dna之间形成酰胺键。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的单链信号dna修饰的次级抗体使用生物素和链霉亲和素之间的相互共价结合。

5.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述的双链链接dna使用限制性核酸内切酶特异性酶切的方法处理，释放三明治结构的免疫复合物。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：通过液滴发生器将游离免疫复合物加载到油包水（w/o）微滴中，所述的液滴发生器类型包括离心式、微流控芯片式或振荡式。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的单链信号dna扩增包括实时荧光定量pcr、环介导的等温扩增；dna扩增染料包括双链dna结合染料或分子探针。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的目标蛋白的来源包括动物、植物、

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述的目标蛋白的来源为未经处理或者预处理后的人的体液，包括血清、尿液、脑脊液，或唾液。

10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：

技术总结
本发明公开了一种超灵敏数字化免疫传感方法，磁颗粒与初级抗体偶联；次级抗体利用单链信号DNA修饰；所述的初级抗体、次级抗体分别识别目标蛋白形成三明治结构的磁颗粒免疫复合物；分离除去磁颗粒，得到游离的三明治结构的免疫复合物；通过液滴发生器将游离的三明治结构的免疫复合物加载到油包水（W/O）微滴中；扩增单链信号DNA，产生荧光微滴；计数荧光微滴从而得到目标蛋白的含量。本发明具有操作简单、成本低、适用性广、灵敏度高和特异性强等优势，可应用于多个领域，多个物种，尤其是对于体外诊断、筛查、生物标志物的发现等应用具有较高的价值。

技术研发人员：程潇羽,何赛灵,张川,郑凯欣,张冉冉,朱易成,夏林骁,马一承
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15