甲基杆菌亚砜合成酶MpEgtB突变体及其应用

本发明涉及甲基杆菌亚砜合成酶mpegtb突变体及其应用，属于生物工程。

背景技术：

1、麦角硫因(l-ergothioneine,l-egt)是一种组氨酸衍生的硫醇化合物，一个多世纪前从麦角真菌(claviceps purpurea)中分离获得。因为具有特殊的硫酮结构和较高的氧化还原电势，egt在生理ph条件下不易发生自氧化，具有比谷胱甘肽更高的稳定性和抗氧化活性，可参与维持机体细胞内的氧化还原态、调节能量、预防癌症和心血管疾病等。然而，研究表明人体自身不能合成麦角硫因，只能从蘑菇和红豆等饮食中摄取。目前，对egt作为膳食补充剂和化妆品添加剂的市场需求日益旺盛，天然来源的egt无法满足需求。

2、egt的制备方法主要包括天然生物提取法、化学合成法和生物合成法，其中提取法来源受限，难以实现大规模工业化生产；化学合成法难度大，产品安全性难以保证；生物法具有安全环保、产量易扩大、生产可持续性等优点，是egt制备的主要发展方向。现已报道了egt的好氧生物合成途径和厌氧生物合成途径，主要包括egt在以分枝杆菌(mycobacteria)为代表的原核生物中的合成途径、以粗糙脉孢菌(neurospora crassa)为代表的真核生物中的合成途径，以及以泥生绿菌(chlorobium limicola)为代表的厌氧菌生物合成途径。以这些合成途径为指导，利用未经基因工程改造的天然可食用蕈菌，如金针菇(flammulinavelutipes)、平菇(pleurotus ostreatus)和香菇(lentinus edodes)等发酵制备egt，通过建立积累egt的深层发酵控制策略，摇瓶发酵液中egt的积累量超过500mg/l(梅保良等,2015)；通过麦角硫因生物合成酶的异源表达，构建egt生产的工程菌，通过前体氨基氨酸的合成途径改造与优化等策略进一步提高egt合成效率。专利(cn 113234652 a)公开了将egt合成基因egtbcde与异源的麦角硫因合成途径酶egt1组合，同时表达大肠杆菌基因gsha的同工酶egta，获得工程菌e1 a1的egt产量为125.8mg/l；进一步对工程菌e1 a1的组氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸代谢改造，获得工程菌的egt产量提高到244.97mg/l，在3l发酵罐分批补料发酵108h，获得的egt产量为1102.96mg/l。

3、然而，目前关于egt合成途径关键酶的改造方面的研究报道并不多见，osawa r等(j agric food chem.2018feb 7；66(5):1191-1196)提出原核生物耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)egtb酶是合成egt的限速酶。对包括egtb酶在内的麦角硫因合成途径上的关键酶进行改造，提高酶的催化性能，有望提升egt的生物合成水平，为生物酶法合成egt的工业化应用提供参考。

技术实现思路

1、本发明提供了一种可以高效制备l-egt的甲基杆菌(methylobacteriumpseudosasicola)来源的亚砜合成酶mpegtb突变体及其改造方法，并利用该突变体蛋白催化组氨酸三甲基内盐(her)，以l-cys为硫供体直接转化为组氨酸三甲基内盐基半胱氨酸亚砜(cys-her)，以及进一步将得到的突变体与耻垢分枝杆菌(mycobacterium smegmatis)来源的sam(s-腺苷蛋氨酸)依赖型组氨酸甲基转移酶msegtd、plp结合型c-s裂解酶msegte偶联，以l-his和l-met为底物制备l-egt。

2、本发明提供了一种m.pseudosasicola来源的亚砜合成酶mpegtb突变体，所述突变体为，以氨基酸序列如seq id no.1所示的亚砜合成酶mpegtb为出发序列，对第106、173和409位氨基酸中的一个或多个进行突变得到的。

3、在本发明的一种实施方式中，编码所述亚砜合成酶mpegtb亲本酶的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第106位酪氨酸突变为苯丙氨酸，获得突变体mpegtby106f。

5、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第173位亮氨酸突变为苏氨酸，获得突变体mpegtbl173t。

6、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第409位谷氨酰胺突变为精氨酸，获得突变体mpegtbq409r。

7、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第106位酪氨酸突变为苯丙氨酸，并第173位亮氨酸突变为苏氨酸，获得突变体mpegtby106f/l173t。

8、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第106位酪氨酸突变为苯丙氨酸，并第409位谷氨酰胺突变为精氨酸，获得突变体mpegtby106f/q409r。

9、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第173位亮氨酸突变为苏氨酸，并第409位谷氨酰胺突变为精氨酸，获得突变体mpegtbl173t/q409r。

10、在本发明的一种实施方式中，所述突变体相对于mpegtb亲本，将其第106位酪氨酸突变为苯丙氨酸，并将第173位亮氨酸突变为苏氨酸，同时将第409位谷氨酰胺突变为精氨酸，获得突变体mpegtby106f/l173t/q409r。

11、在本发明的一种实施方式中，所述突变体mpegtby106f、mpegtbl173t、mpegtbq409r、mpegtby106f/l173t、mpegtby106f/q409r、mpegtbl173t/q409r、mpegtby106f/l173t/q409r的氨基酸序列分别如seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq id no.9、seq id no.11、seq id no.13、seq id no.15所示。

12、本发明还提供了编码所述突变体的基因。

13、在本发明的一种实施方式中，编码所述突变体mpegtby106f、mpegtbl173t、mpegtbq409r、mpegtby106f/l173t、mpegtby106f/q409r、mpegtbl173t/q409r、mpegtby106f/l173t/q409r的基因的核苷酸序列分别如seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq id no.10、seq idno.12、seq id no.14、seq id no.16所示。

14、本发明提供了一种获得所述mpegtb突变体的方法，所述方法包括以下步骤：

15、(1)以携带seq id no.2所示m.pseudosasicola来源的亚砜合成酶mpegtb基因的载体为模板进行定点突变；构建含突变体的质粒载体；

16、(2)将步骤(1)构建的质粒载体转化进宿主细胞，挑选阳性克隆；

17、(3)挑选步骤(2)制备的阳性克隆进行发酵培养，并纯化mpegtb。

18、本发明还提供了携带所述基因的重组载体。

19、在本发明的一种实施方式中，所述重组载体是以prsfduet-1或pacyc-duet-1为表达载体。

20、在本发明的一种实施方式中，所述载体为含有编码mpegtb突变体mpegtby106f/l173t/q409r基因的重组载体；所述重组载体是将seq id no.16所示mpegtb突变体mpegtby106f/l173t/q409r基因整合至表达载体prsfduet-1，从而得到重组表达载体prsfduet-mpegtb。

21、本发明还提供了表达上述突变体或携带编码上述突变体的基因或携带上述重组载体的微生物细胞。

22、在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞是以细菌和真菌为表达宿主。

23、在本发明的一种实施方式中，所述微生物细胞为大肠杆菌，包括但不限于大肠杆菌bl21(de3)。

24、本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌同时过表达了上述甲基杆菌亚砜合成酶mpegtb突变体、依赖型组氨酸甲基转移酶msegtd和plp结合型c-s裂解酶msegte。

25、在本发明的一种实施方式中，编码所述msegtd的核苷酸序列如seq id no.17所示，编码所述msegte的核苷酸序列如seq id no.18所示。

26、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以大肠杆菌为表达宿主。

27、在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌是以e.coli bl21(de3)为表达宿主。

28、在本发明的一种实施方式中，采用pacyc-duet-1载体过表达了依赖型组氨酸甲基转移酶msegtd和plp结合型c-s裂解酶msegte，采用prsf-duet-1过表达了mpegtb突变体。

29、在本发明的一种实施方式中，所述载体含有编码msegtd基因以及msegte基因的共表达载体；所述重组载体是将如seq id no.17所示msegtd基因以及如seq id no.18所示msegte基因整合至表达载体pacyc-duet-1，从而得到共表达载体pacyc-duet-egtde。

30、本发明还提供了一种含有重组载体prsfduet-mpegtb和共表达载体pacyc-duet-egtde的重组大肠杆菌bl21-egtbde。

31、本发明还提供了一种麦角硫因的制备方法，所述方法为，以上述基因工程菌或重组细胞为催化剂，催化l-组氨酸和l-甲硫氨酸，生产麦角硫因。

32、在本发明的一种实施方式中，所述方法是，将大肠杆菌bl21-egtbde按照2-10％的接种量接种至发酵罐中，培养3h，添加终浓度0.5mmol/l的iptg进行诱导，诱导温度为30℃，诱导时间24h，发酵结束后以8000rpm转速离心收集菌体，-20℃保存菌体备用。

33、在本发明的一种实施方式中，所述方法为，以l-his、l-cys和l-met为反应底物，以bl21-egtbde细胞作为催化剂，反应2-3h后，向转化体系连续补加l-his和l-met，在100mmtris-hcl缓冲液、ph7.0～9.0、20～35℃条件下反应24～72h。

34、本发明还提供了一种所述mpegtb突变体或上述基因或上述重组载体或上述重组细胞或上述基因工程菌或上述重组大肠杆菌bl21-egtbde在制备含l-egt的产品，或以l-egt为原料生产的产品中的应用。

35、有益效果

36、(1)本发明构建了一种甲基杆菌(m.pseudosasicola)来源的亚砜合成酶mpegtb突变体，用于催化生产l-egt。本发明突变体的比酶活(4.32u mg-1蛋白)和kcat/km(0.93)较对照分别提高了31倍和103倍，提高了单位催化剂的生产能力，有效降低了生产成本。

37、(2)本发明所述的双质粒表达菌株可以通过培养来大批量获得，且不需要细胞破碎，直接用于转化反应，操作简便。在5l反应体系中以重组大肠杆菌bl21-egtbde为全细胞催化剂，采用连续补加l-his和l-met的策略可获得l-egt的产量可达8.32g/l，加快了酶转化法生产l-egt的工业化进程。