一种重组甲基营养杆菌及其应用的制作方法

专利名称：：一种重组甲基营养杆菌及其应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种重组甲基营养杆菌及其应用。技术背景L-丝氨酸属生糖氨基酸，是组成蛋白质的20种基本氨基酸之一。L-丝氨酸虽属于非必需氨基酸，但具有许多重要的生理功能和作用L-丝氨酸是合成嘌呤、胸腺嘧啶、胆碱的前体；L-丝氨酸的羟基经磷酸化作用后，能衍生出具重要生理功能的磷丝氨酸，磷丝氨酸具有解除疲劳、恢复体力等功效；L-丝氨酸具有稳定滴眼液pH值的作用，且滴眼后无刺激性；L-丝氨酸是重要的自然保湿因子(NMF)之一，是皮肤角质层保持水分的主要角色，高级化妆品中的关键添加剂；同时丝氨酸的衍生物也具有优良的药用和生物活性，如a—取代丝氨酸被应用于设计肽，而且是免疫抑制剂ISP(多球壳菌素myriocin，嗜热菌杀酵母素thermozymocidin)和免疫激活剂、神经鞘真菌素E等生物活性物质的有效组成部分；由L-丝氨酸制成的偶氮丝氨酸常用于治疗肿瘤。在世界氨基酸生产行业中，L-丝氨酸是工业化生产难度较大的氨基酸。虽然L-丝氨酸可从蚕丝水解液中提取，但是，其得率低、成本高、利润薄。由于技术原因，我国目前还不能大规模地生产L-丝氨酸，国内使用的L-丝氨酸基本靠国外进口。目前L-丝氨酸的生产方法主要有蛋白质水解法、化学法和微生物发酵法三种方法。国内主要采用蛋白质水解法生产L-丝氨酸，但其产量低、效率低、成本高，国外应用较多的方法是利用微生物发酵生产L-丝氨酸。L-丝氨酸处于氨基酸代谢的中间位置，在体内代谢运转速度极快。与其他氨基酸相比，L-丝氨酸很难直接利用微生物发酵法生产。现有的L-丝氨酸生产方法大多采用以甘氨酸、甘氨酸三甲内盐或甘油酸为前体利用微生物发酵生产，所采用的微生物种类较多，大致可以分为两类，即甲基营养型细菌和异养型细菌(如嗜甘氨酸棒杆菌、诺卡氏菌等)。其中研究得最多、L-丝氨酸产量最高的是甲基营养型细菌。甲基营养型细菌是一类可以利用甲醇等单碳化合物作为唯一碳源和能源进行生长的微生物。根据其利用碳源情况的不同，甲基营养型细菌可以分为以下三类1、严格甲基营养型细菌(oW/gflfemW/^/Wrap/w)，如Me^;/o6ac"/1^，此类细菌只能利用单碳化合物作为唯一碳源进行生长；2、限制性兼性甲基营养型细菌("Wn'"W/ac^加'vewe^;/Wra;/w)，如M"/zy/o;/H7t^，此类细菌除了能在以单碳化合物为碳源的培养基上生长外，还能利用小范围的多碳化合物作为碳源和能源；3、典型的兼性甲基营养型细菌(《y/7/ca//ac^a"wmeA;;/o加;fo)，如M"/^/ovon^，此类细菌比限制性兼性甲基营养型细菌利用的多碳化合物的类型更多。由于甲基营养型细菌具有极为相似的形态学和代谢机制的特点，用于分类到不同属或种的标准还得根据其遗传和生理生化特性来决定。能进行发酵生产L-丝氨酸的微生物种类丰富，包括/fy-om/cro&調sp.、她鄉/。6octe,/,sp.、尸-yewc/o腳"a51sp.、TVocaWasp.、5^cz'"asp.等。目前已经分离到多株产L-丝氨酸的甲基营养型细菌菌株。如Izumi等筛选鉴定到1株产L-丝氨酸的嗜甲基生丝微菌(//j^^,'cra6/wmme^y/o6orwm)菌株KM146，KM146菌株在含48mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、30mg/ml菌体、Tris-HC1(pH9.0)0.05mmol/ml的反应体系中，于28。C振动培养3天后，可以生成24mg/ml的L-丝氨酸，摩尔转化率为17%。Yoshida等筛选到一株生丝微菌(/fyp/zom/cro6&m印.)菌株NCIB10099，NCIB10099菌株在含88mg/ml甲醇、100mg/ml甘氨酸、40mg/ml菌体、Tris-HC1(pH9.O)的反应体系中，于28°C振动培养3天，可以生成43rag/ml的L一丝氨酸。1986年，Sirirote等报道了利用扭曲甲基杆菌(M"/zy/ok7"en^wexto^wem)菌株NR1生产L-丝氨酸的情况，研究表明，在甲醇浓度为10mg/ml、甘氨酸浓度为100mg/ml、细胞浓度为30.94mg/ml、溶解氧为0.5ppm、反应温度为30°C、控制pH的条件下，反应24小时，可以获得24.9mg/ml的L-丝氨酸。Hagishita等从土壤中分离到产L-丝氨酸的甲基杆菌(Me^y/o6actehwm印.)菌株MN43，研究表明，在甲醇浓度为104mg/ml、甘氨酸浓度为50mg/ml的条件下，反应5天后，可以获得65mg/ml的L-丝氨酸，摩尔转化率为93%。这是目前已报道的利用甲醇和甘氨酸生产L一丝氨酸产量和摩尔转化率最高的一株甲基营养型细菌。Morinaga等分离到一株兼性甲基营养型细菌MS31，鉴定为假单胞菌(/^Womoww取)，在培养后期添加甘氨酸和甲醇后，MS31菌株可以积累2.5mg/ml的L-丝氨酸。通过诱变获得的邻甲基丝氨酸抗性突变体S395可以积累10-12mg/ml的L-丝氨酸。丝氨酸羟甲基转移酶基因(gJj^)广泛存在于各种生物体中，是生物体中的一种重要基因，并能自身编码产生丝氨酸羟甲基转移酶(serinehydroxymethyltransferase,SHMT)。自然界中的细菌体内一般都含有基因，如细菌中的Eco"。在体外条件下，当有一定浓度的四氢叶酸存在时，SHMT可以催化甲醛和甘氨酸可逆的合成L-丝氨酸。
发明内容本发明的目的是提供一种重组甲基营养杆菌。本发明的重组甲基营养杆菌，是将丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到原核细胞表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到重组菌，以该重组菌作为供体菌，以转入帮助质粒pRK2073或pRK2013(购自Promega公司)的重组大肠杆菌为帮助菌，以甲基营养杆菌(Me^yZo^cten'謂sp.)MB200为受体菌，通过三亲本杂交将所述重组表达载体导入到甲基营养杆菌(M"/o^cteW"msp.)MB200中，得到重组甲基营养杆菌。所述原核细胞表达载体可为现有的能在大肠杆菌细胞内表达复制的载体，如pLAFR3。所述重组表达载体为将所述丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到pLAFR3的多克隆位点，得到的重组表达载体pLAFRg。其中，所述丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNumberL33463所示。所述三亲本杂交是将供体菌、协助菌与受体菌混合起来，使菌体细胞紧密接触，供体中的质粒在协助质粒的帮助下通过接合转移方式导入受体菌中。所述丝氨酸羟甲基转移酶基因的编码序列具体可为序列表中序列1的自5'端第79—1383位核苷酸。其中，自5'端第79—1383位核苷酸是该基因的开放阅读框架，自5'端第79—81位核苷酸为该基因的起始密码子ATG,自5'端第1381—1383位核苷酸为该基因的终止密码子TAA。所述三亲本杂交中的供体菌为将pLAFRg导入大肠杆菌(如DH5a)中得到的重组菌；所述帮助菌为将帮助质粒pRK2073或pRK2013(购自Promega公司)导入大肠杆菌(如DH5a)得到的重组菌。其中，所述重组甲基营养杆菌具体可为甲基营养杆菌(Me^y/o^"m'wmsp.)MB202，已于2007年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCCN2M207126。本发明的第二个目的是提供一种生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法。本发明所提供的生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法，是发酵培养所述重组甲基营养杆菌，得到丝氨酸羟甲基转移酶。所述发酵培养的培养基按照如下方法配制(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg，维生素Bl10iig、核黄素20"g、泛酸钙20ug、维生素B620wg、生物素1ug、对氨基苯甲酸10ug，加水到1000ml，pH7.0，灭菌后加入体积百分比为1.25%的甲醇；所述发酵的培养温度为28—32'C;培养时间为48—72小时。本发明的第三个目的是提供一种生产L-丝氨酸的方法。本发明所提供的生产L-丝氨酸的方法，是培养上述重组甲基营养杆菌的静息细胞，得到L-丝氨酸。所述静息细胞的培养体系为甘氨酸10-60rog，甲醇50-100mg，菌体108—109CFU，pH8.5的50慮Tris-HCl至终体积lmL;所述培养温度为28-37°C，所述培养时间为48-72小时。本发明构建的重组甲基营养杆菌能通过发酵培养生产丝氨酸羟甲基转移酶，丝氨酸羟甲基转移酶的酶活力达到115U，是出发菌株MB200的3.5倍；还能够通过培养重组甲基营养杆菌的静息细胞转化甘氨酸和甲醇生产L-丝氨酸，L-丝氨酸的产量达11.5mg/mL，与出发菌株MB200相比，提高了5倍。而且本发明生产L-丝氨酸的方法中，利用甲醇和甘氨酸为原料，成本低，可以获得较高的利润。本发明的重组甲基营养杆菌在生产L-丝氨酸、丝氨酸羟甲基转移酶和处理甲醇废水中都有具有十分广阔的应用前景。图1:MB200基因组DNA分别经5amHI、///^/III酶切后的Southern杂交结果图2:基因文库的菌落原位杂交免疫反应显影图3:g义W基因在大肠杆菌中的表达图4:重组菌株MB202提取质粒的酶切验证结果图5:野生菌株MB200生长时期与SHMT酶活情况分析图6:重组菌株MB202生长时期与S丽T酶活情况分析图7:薄层层析检测MB202静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸图8:L-丝氨酸与甘氨酸标准溶液混合后的定量分析图9:MB200静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测图10:MB202静息细胞反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测具体实施方式本发明实施例中所用到的材料包括大肠杆菌(^c/zen'c/z/aco//)Tuner(DE3)(购自Novagen公司)；载体为pLAFR3(购自Promega公司)；抗生素、限制性内切酶、修饰酶、TaqE、dNTP、pGEMT-easy载体试剂盒购自Promega公司，其它化学试剂购自广西蓝天实业有限公司。在本发明实施例中所用到的培养基培养甲基营养杆菌的mediumII培养基(即M培养基)(1000ml)(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg,微量元素维生素Bl10ixg、核黄素20ug、泛酸钙20ng、维生素B620yg、生物素liig、对氨基苯甲酸10ug，加水到1000ml，pH7.0，灭菌后在超净台内加入1.25%(体积百分比)的甲醇，固体培养基加入llg的琼脂粉。LA培养基的组成(1000ml):10.0g胰蛋白胨(购自Oxoid公司)；5.Og酵母浸出粉(购自Difco公司)；5.0gNaCl;pH7.0，琼脂粉1.2%。实施例l、重组甲基营养杆菌MB202的制备一、^州基因的克隆1、三亲本杂交的受体菌-甲基营养杆菌(A/e^y/o6acfeWwwsp.)MB200CGMCCNo1526的筛选从广西隆安县某沼气池中采集泥样0.5g，加入到含100mlmediumII液体培养基的三角瓶中，32。C摇床培养3天，将培养好的菌液按1%的接种量转接到100mlmediumII液体培养基中继续于32。C摇床培养3天，取100y1上述菌液稀释涂布于mediumII固体培养基上，32匸培养3天，待长出菌落后，用接种环挑取单菌落接种于mediumII固体培养基上，将长出的单菌落分别编号，其中编号为MB200的菌株经鉴定为甲基营养杆菌(M"/y;/ok/"m'wwsp.)，其保藏号为CGMCCNo1526。2、探针的制备根据Me^y/o6acfeWwmextor《we"sAMl的gJ/J基因序歹!j(GenBankAccessionNumberL33463)使用vectorNTI软件设计合成了一对丝氨酸羟甲基转移酶部分基因的特异引物GF和GR，GF为5'-CGACTCCTTCTTCTCGGCTC-3'，GR为5'-CGTTCTTGTTGCAGGTGATG-3'，以MB200的基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小约0.65Kb的DNA片段，该片段经序列测定后发现与Mexto^we似AMl的^/^基因序列相似性达到95%，确定从MB200中扩增到部分^7j^基因片段。作为下一步Southem杂交的探针。3、Southern杂交根据VectorNTI软件分析的探针酶切位点图谱，选择适当的限制性内切酶对MB200的基因组DNA进行Southern杂交验证。用限制性内切酶5am^1、历"dIII分别完全酶切MB200基因组DNA，将PCR产物经Promega公司的杂交专用试剂盒标记后作为探针，杂交之前的基因组DNA酶切、电泳、转膜等按文献所述方法进行(YoshitakeTanaka,KazumiArakiandKiyoshiNakayama.1980,StrainimprovementofNocardiabutanicaformicrobialconversionofglycineintoL國serine.Ferment.Technol,58(2):163-166.)，然后58。C预杂交2—4h，以随机引物标记试剂盒标记探针，65。C杂交过夜，在严格条件下洗膜，压磷屏，用AmershamBiosciences公司的Typhoon9410扫描成像。结果表明用5am^1、历"dlII两种酶分别酶切处理MB200基因组DNA，均出现阳性杂交带，阳性杂交带的大小分别为3.5Kb、22Kb左右，结果如图l所示，其中，M为1KbDNAMarker;l为5amHI酶切结果；2为///"dill酶切结果。根据基因大小和阳性印记片段的大小，选用酶切基因组DNA的产物作为构建文库的外源DNA。4、基因文库构建为了获得完整的Wjo4基因，在构建以pGEM-3Zf(+)(购自Promega公司)为载体的文库时，将MB200的基因组DNA用^am^1完全酶切，回收3.5Kb附近的酶切片段用于文库的构建。将上述回收的3.5Kb附近的酶切片段与经过相同酶切后去磷酸化的质粒载体pGEM-3Zf(+)相连接，形成重组表达质粒。将连接产物用电脉冲方法导入宿主感受态细胞DH5a内，经过l小时的预培养后，涂布于含有X-gal(40ug/ml)、IPTG(40ng/ml)、氨节青霉素(Amp)(50ug/ml)的LA平板上，37X:恒温培养过夜，筛选得到约3000个白色转化子。5、菌落原位杂交将所获得的白色菌落按相应位置点在杂交尼龙膜上，置于含Amp的LA平板上培养12小时，待菌落大小在2mm左右时，用Southern杂交的方法进行菌落原位杂交，结果如图2。结果得到10个可能的阳性菌落。6、阳性克隆序列分析将其中一个阳性菌落提取质粒，酶切验证后，送至大连宝生物公司进行测序。测序结果表明，该阳性菌含有序列表中序列1所示的DNA序列。其中，序列自5，端的第79—1383位核苷酸为^7j^基因的开放阅读框(OpenReadingFrame,ORF)，编码如GenBankAccessionNumberL33463所示的^j^;自5，端的第79—81位核苷酸为^/j^基因的起始密码子ATG,自5'端的第1381—1383位核苷酸为g义W基因的终止密码子TAA。7、g义W基因在大肠杆菌中的表达根据上述测序的基因序列设计引物P1(5，-CTAGGATCCCATGAGCGCCGGAACTG-3')、P2(5'-ACGAAGCTTGTTGTAGATCGGGAAGC-3')，下划线分别为5am肌和///^/111的酶切位点，以10ngMB200的基因组DNA为模板，PCR扩增序列1的自5'端第79—1383位核苷酸，其它反应物按说明书添加，反应程序为96。C2min，95°C50sec，61°C50sec，72°C1.5min,30个循环，72°C5min。将该PCR产物进行测序，结果表明该PCR扩增产物的核苷酸序列是序列表中序列1的自5'端第79-1383位核苷酸。将该PCR扩增得到的产物经琼脂糖凝胶电泳再经试剂盒纯化，用5amM和///"dill双酶切该片段，回收后连接到用同样酶切处理的pET-blue(购自Novagen公司)载体上，将该重组表达载体命名为pET:og，然后将重组表达载体pET:og导入到大肠杆菌Tuner(DE3X购自Novagen公司)中，得到了重组表达菌株Tuner(pet:og)。同时，将pET-blue转入大肠杆菌Tuner(DE3)中，得到重组菌株Tuner(pet:blue)。接种Tuner(pet:og)于3mlLB培养基中，培养过夜。将3ml菌液全部加入到盛有100mlLB液体培养基的250ml三角瓶中，振荡培养。当OD,到0.4—0.6时加入IPTG至终浓度为1.OmM，诱导培养4一5小时左右。将诱导表达的菌液于10000rpm，4'C离心，收集菌体。超声波破碎细胞，15000rpm离心20min去除细胞残留物，将上清液进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，检测SHMT蛋白是否表达及其可溶性，检测结果如图3所示，其中，1:纯化的SHMT蛋白(用Ni柱亲和层析纯化。具体方法将上述细胞破碎后离心的上清液装填Ni-NTA亲和层析柱，按常规方法上Ni+层析柱先平衡层析柱，平衡缓冲液(20raraol/LTirs-HCl，0.5mol/LNaCl，5ramol/L咪唑pH7.9);低速上样后，再用同样的平衡缓冲液洗柱以去除杂蛋白；最后洗脱目的蛋白，洗脱缓冲液(20mmol/LTirs-HC1，0.5mol/LNaCl，10—200mmol/L咪唑)，收集洗脱峰，得到纯化的SHMT蛋白)，2:从上至下依次为116.0，66.2，45.0，35.0，25.0，18.4，14.4kDa的蛋白质分子量标准，菌株Tuner(pet:og)的诱导表达结果，4:对照菌株Tuner(pet:blue)的诱导表达结果。结果表明，得到48kDa的SHMT，且该蛋白可溶。二、三亲本杂交制备重组甲基营养杆菌MB202将上述步骤一的7中得到的PCR产物经///Mdl11和Sam^I酶切后连接到用同样酶切处理的pLAFR3(购自Promega公司)载体上，得到重组表达质粒，将该重组表达质粒命名为pLAFRg，将pLAFRg导入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，得到的重组菌作为供体菌；将帮助质粒pRK2073(购自Promega公司)转入大肠杆菌DH5a感受态细胞中，得到的重组大肠杆菌作为帮助菌；以甲基营养杆菌(Me,/^/ok/"e^msp.)MB200为受体菌，通过三亲本杂交将pLAFRg导入到甲基营养杆菌(Me^y/o6a"en^msp.)MB200中，得到重组甲基营养杆菌MB202。具体方法如下将上述供体菌、帮助菌、受体菌三种菌都培养到对数生长期，将以上菌液按照1:1:4的体积比混合均匀，离心收集菌体，TE洗3次，然后点到共培养基(M+20X(体积百分含量)LB)平板上，32i:共培养2-3天。挑取单菌落稀释涂布到含四环素(15ug/ml)和萘啶酮酸(50ug/ral)两种抗生素的M培养基平板上进行筛选，得到的筛选子进一步提取质粒用历'"oTI1和fey^I进行双酶切鉴定，其中编号为MB202的菌株的质粒酶切鉴定结果如图4，其中，M为1KbDNAMarker,泳道l为从重组甲基营养杆菌MB202中提取的质粒，泳道2为该质粒经必'/^rn和酶切后的酶切结果。说明甲基营养杆菌(Me^y/oZ^cten'wmsp.)MB202是将重组表达质粒pLAFRg导入到甲基营养杆菌(Af"/o6acten'wmsp.)MB200得到的重组甲基营养杆菌。甲基营养杆菌(Me^y/o6"cfen'wmsp.)MB202已于2007年8月8日保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC，地址为中国武汉武汉大学)，保藏登记号为CCTCCN2M207126。实施例2、甲基营养杆菌(Me/A>;/o6a"m'wmsp.)MB202cctccNqM207126生产丝氨酸羟甲基转移酶和L-丝氨酸的能力检测一、甲基营养杆菌(Me^y/otocfeWwmsp.)MB202CCTCCNqM207126生产丝氨酸羟甲基转移酶为了确定菌株的SHMT酶活力与生长时期的关系，将菌株MB200和MB202分别接种于mediumII液体培养基中，于32"C培养12小时后，每3小时测定一次菌液的0DW()值，并收集0.6mg的湿菌体(2X106—2X107CFU)测定酶活。其中酶活的测定方法是lral酶反应体系中含50mM磷酸缓冲液(pH8.5)，0.05mmol/mlDL-3-苯基丝氨酸，0.05umol/ml磷酸吡眵醛，0.03%CTAB及0.6mg的湿菌体(2X106—2X10'CFU)，反应温度45。C，酶活力单位以每小时产生l咖ol苯甲醛的量为一个酶活力单位。实验设3次重复，检测结果如图5和图6所示，表明甲基营养杆菌/otocten'wwsp.)MB200CGMCCNo1526在培养33小时酶活达到最高，每毫克菌体的酶活为33U±4U(平均值士标准差)，g卩33U±4U/3.3X106—3.3X107CFU;甲基营养杆菌(Me^;/o6acten'wmsp.)MB202CCTCCNsM207126在培养36小时，酶活达到最高，每毫克菌体的酶活为115U±5U(平均值土标准差)，即115U±5U/3.3X106-3.3X107CFU。MB202的最高酶活是MB200最高酶活的3.5倍。图5和图6中的数据是3次重复的平均值。二、生产L-丝氨酸1、静息细胞培养接种一环甲基营养杆菌(Me^;/o^"m'wmsp.)MB202CCTCC他M207126到lOmLmediumII培养基中，32t:摇床培养3天。然后转接lmL培养物到lOOmL新鲜的mediumII培养基中，继续32"摇床培养到0D6。。为0.8-1.0(即培养24-32小时)，4"C条件下，8000rpm离心10分钟收集菌体。同时，以相同方法培养的甲基营养杆菌(Me^y/o6acter/wmsp.)MB200CGMCCNo1526作为对照。将收集的菌体用生理盐水洗3次后，按以下次序将各成分在指形瓶内混合Tris-HCl(pH8.5)50mM，甘氨酸10mg，甲醇50mg，菌体30rag(108—109CFU)，加50raMTris-HC1(pH8.5)至终体积lmL。置于32。C摇床上培养48hr，13000rpm离心10分钟，取上清液，-2(TC保存待测。其中，上述摇床的转速为200rpm，离心半径为135mm。2、L-丝氨酸检测(1)L-丝氨酸定性分析DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析采用聚酰胺薄膜(10X10cm)。吸取培养上清液于EP管中，加入等体积的DNS-C1丙酮溶液。于4(TC恒温箱保温30分钟，移入8(TC烘箱10分钟。加入1mol/L盐酸至pH2—3，加入水饱和的乙酸乙酯充分混匀。取上层液点样，以苯冰醋酸(9:1)为展开剂展开，在紫外光下看到黄色荧光，采用L-丝氨酸(购自Sigma公司，产品目录号为CA-118)和甘氨酸(购自Sigma公司，产品目录号为CA-066.)作对照，通过与对照比较判断有L-丝氨酸的产生。DNS-氨基酸聚酰胺薄膜层析结果如图7所示，其中，CK:L-丝氨酸标准品和甘氨酸标准品混合液的薄膜层析结果，l:待测样品的薄膜层析结果。(2)L-丝氨酸定量分析反应体系离心取上清液送广西分析测试研究中心测定，采用日本日立公司的氨基酸自动分析仪L-8800AAAsystemhanager，柱子为26223C柱，检测L-丝氨酸的含量和甘氨酸的残留量。结果如图8、9、IO所示，其中，图8:L-丝氨酸与甘氨酸标准溶液混合后的定量分析结果，图9:甲基营养杆菌(MW/z;;/o6acten^msp.)MB200CGMCCNq1526发酵反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测结果，图10:甲基营养杆菌(Me^y/o6acten'wwsp.)MB202cctccNqM207126发酵反应液中L-丝氨酸与甘氨酸的定量检测结果。3次重复实验的结果表明，甲基营养杆菌(MW/^/o6acten'wmsp.)MB202CCTCCNsM207126每毫升反应体系中L—丝氨酸的含量为11.5rag±0.2mg(平均值士标准差)，即11.5mg土0.2mg/108-109CFU，甲基营养杆菌(M"ty/o6acten、msp.)MB200CGMCCNs1526每毫升反应体系中L一丝氨酸的含量为2.8mg士0.2mg(平均值士标准差)，即2.8mg土0.2mg/108—109CFU。序列表<<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>权利要求1、一种重组甲基营养杆菌，是将丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到原核细胞表达载体的多克隆位点，得到重组表达载体，再将所述重组表达载体导入大肠杆菌中得到重组菌，以该重组菌作为供体菌，以转入帮助质粒pRK2073或pRK2013的重组大肠杆菌为帮助菌，以甲基营养杆菌(Methylobacteriumsp.)MB200为受体菌，通过三亲本杂交将所述重组表达载体导入到甲基营养杆菌(Methylobacteriumsp.)MB200中，得到重组甲基营养杆菌；所述甲基营养杆菌(Methylobacteriumsp.)MB200的保藏号为CGMCCNo1526。2、根据权利要求l所述的重组甲基营养杆菌，其特征在于所述重组表达载体为将所述丝氨酸羟甲基转移酶基因插入到pLAFR3的多克隆位点，得到的重组表达载体pLAFRg;所述三亲本杂交中的供体菌为将pLAFRg导入大肠杆菌中得到的重组菌；所述帮助菌为将帮助质粒pRK2073或pRK2013导入大肠杆菌中得到的重组菌。3、根据权利要求2所述的重组甲基营养杆菌，其特征在于所述大肠杆菌为DH5a。4、根据权利要求l、2或3所述的重组甲基营养杆菌，其特征在于所述丝氨酸羟甲基转移酶的氨基酸序列如GenBankAccessionNumberL33463所示。5、根据权利要求4所述的重组甲基营养杆菌，其特征在于所述丝氨酸羟甲基转移酶基因的编码序列是序列表中序列1的自5'端第79—1383位核苷酸。6、根据权利要求5所述的重组甲基营养杆菌，其特征在于所述重组甲基营养杆菌为甲基营养杆菌(Me^y/o6fl"er/wwsp.)MB202，其保藏号为CCTCCNoM207126。7、一种生产丝氨酸羟甲基转移酶的方法，是发酵培养权利要求1至6中任一所述的重组甲基营养杆菌，得到丝氨酸羟甲基转移酶。8、根据权利要求7所述的方法，其特征在于所述发酵培养的培养基按照如下方法配制(NH4)2HP043g、K2HP042g、NaCllg、MgS047H200.2g、FeS047H2010mg、MnS044-6H205mg，维生素Bl10yg、核黄素20ng、泛酸转20ug、维生素B620iig、生物素lug、对氨基苯甲酸lOyg，加水到1000ml，pH7.0，灭菌后加入体积百分比为1.25%的甲醇；所述发酵的培养温度为28—32。C;培养时间为48—72小时。9、一种生产L-丝氨酸的方法，是培养权利要求1至6中任一所述的重组甲基营养杆菌的静息细胞，得到L-丝氨酸。10、根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述静息细胞的培养体系为甘氨酸10-60mg，甲醇50-100mg，菌体108—109CFU，pH8.5的50raMTris-HCl至终体积lmL;所述培养温度为28-37°C，所述培养时间为48-72小时。全文摘要本发明公开了一种重组甲基营养杆菌及其应用。本发明的重组甲基营养杆菌是将glyA基因插入到载体pLAFR3的多克隆位点，得到重组表达载体pLAFRg，再将pLAFRg通过三亲本杂交导入到甲基营养杆菌MB200中，得到重组甲基营养杆菌MB202。MB202在10mg甘氨酸，50mg甲醇，10⁸-10⁹CFU菌体量，pH8.5的50mMTris-HCl至终体积1mL的条件下，32℃摇床培养48小时，L-丝氨酸的产量达11.5mg/mL；MB202在32℃条件下，发酵培养12小时后，丝氨酸羟甲基转移酶的酶活达115U。本发明在利用重组甲基营养杆菌MB202的静息细胞生产L-丝氨酸、在处理甲醇废水中都有具有十分广泛的应用前景。文档编号C12N1/21GK101165172SQ200710175890公开日2008年4月23日申请日期2007年10月15日优先权日2007年10月15日发明者倩欧,波武,申佩弘申请人:广西大学