一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因及其抗重金属应用的制作方法
【专利摘要】本发明将一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因转入植物并使得这种转基因植物能够具备增加植物抗重金属的作用。所述重金属结合蛋白基因按植物偏爱密码合成含234个碱基，编码的氨基酸73个；所述基因的核苷酸序列如SEQ?ID?NO：1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ?ID?NO：2所示。本发明中来源于扭脱甲基杆菌的重简化结合采用人工方法合成，转基因植物具备较高的抗重金属性。
【专利说明】一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因及其抗重 金属应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于遗传育种领域，具体涉及一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白 基因的序列，利用农杆菌将该基因转化到植物中，使植物抗金属能力得到提高。
【背景技术】
[0002] 随着现代工农业的迅速发展、城市的急剧扩大，自然环境中的重金属污染日益严 重。每年因重金属污染带来的粮食减产达1000多万吨，被重金属污染的粮食每年达1200 万吨，年经济损失在200亿以上。传统的土壤重金属污染修复技术有排土填埋法、稀释 法、淋洗法、物理分离法和化学法等因成本高、效率低，而且会破坏土壤结构，导致二次污 染等原因，难以大面积应用。
[0003] 与传统的处理方式相比，植物修复的主要优点是成本低，处理设施简单，适合大 规模的应用，利于土壤生态系统的保持，对环境扰动小，具有美学价值等特点。植物修复 是生物修复（bioremediation)的一种方式，又称绿色修复（green remediation)，是以植 物忍耐、分解或超量积累某种或某些化学元素的生理功能为基础，利用植物及其共存微生 物体系来吸收、降解、挥发和富集环境中污染物的一项环境污染治理技术。
[0004] 然而，植物修复的关键核心问题在于修复的效率问题，本发明通过基因工程技术 提高植物修复的效率，从而希望能引领植物修复技术的新一轮发展。
[0005] 本项发明利用PTDS法合成了来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因，将该 基因转化拟南芥，进而提高了转基因拟南芥的耐重金属能力，该基因对于培育植物抗重金 属的植物品种非常重要，具有重要的理论意义和现实意义。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题在于将一种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白 基因转入植物体内，并对该转基因植物进行功能验证，以证明它具有提高植物的抗重金属 的功能。
[0007] -种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白斯，其核苷酸序列如SEQ ID N0 1所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
[0008] 所述来源于扭脱甲基杆菌的根据植物偏爱人工合成的重金属结合蛋白ife/M炉长 234bp，编码的氨基酸73个。
[0009] 所述来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白ife?炉通过农杆菌介导转入拟南 芥，应用于植物抗重金属性。
[0010] 所述来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因采用人工方法合成，具 体包括以下步骤： 的人工合成 依照PTDS(PCR_based two-step DNA synthesis，PTDS)方法进行源自扭脱甲基杆菌的 重金属结合蛋白基因进行化学合成，在保持基因的氨基酸序列不变的基础上，设计 引物合成了 基因。
[0011] 2 ) 娜SP农杆菌双元载体的构建 #a娜SP基因植物双元载体在pcAMBIA-1301载体的基础上构建而成，在pCAMBIA-1301 载体的多克隆位点处插入两端附加了烟草的染色质附着SAR序列的外源基因的表达单元， 这有利于转基因的稳定遗传；在外源基因的表达单元内，我们在目的基因的两侧导入了 BamHI和Sacl酶切位点，便于外源基因的插入，外源基因的表达由双CAMV355启动子+TMV omega leader sequence 控制。
[0012] 3)电击法转化农杆菌 参照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD公司）制备农杆菌GV3101感受态.并且将构建好的农杆菌 双元载体经电击法转入到农杆菌中。
[0013] 4)农杆菌介导转化拟南芥 利用蘸花法将构建好的农杆菌转入拟南芥体内.首先将拟南芥的花苔浸入渗透液中， 轻轻搅动约3?5秒后取出，全部转化完毕后，托盘中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆 封口，保持湿润环境，置于22°C培养室，低光强度下生长24小时，即可正常培养。生长约两 个月后，收集种子，4 °C冰箱贮存待用。
[0014] 5)拟南芥转化植株种子的筛选 将得到的种子进行筛选，包括GUS组织化学染色分析和转基因阳性植株的PCR检测得 到转入基因的拟南芥。
[0015] 6)转基因拟南芥抗重金属性验证 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星 期。然后将野生型和转基因培养皿小苗用于抗重金属实验。用50〇μΜ浓度的氯化铬溶液处 理野生型和转基因拟南芥株系。处理一周，结果显示在50〇μΜ氯化铬处理下野生型生长明 显受抑制，根系不生长，叶片稀少，而转基因株系抑制较小。结果说明基因明显提高 了拟南芥的抗重金属能力。
[0016] 本发明实现的有益效果 本发明采用PTDS法合成了来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白ife/M炉基因，为了 进一步分析该基因在重金属逆境中的作用与功能，我们比较了转基因的拟南芥植 株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。结果表明，野生型和转基因拟南芥植株在表 型上有很大的差异。结果显示在50〇μΜ浓度的氯化铬浓度培养基处理下野生型生长明显受 抑制，根系不生长，叶片稀少，而转基因株系抑制较小。结果说明iJWC基因明显提高了拟 南芥的抗重金属能力。
【专利附图】
【附图说明】
[0017] 图1是用于拟南芥转化的植物表达载体示意图。
[0018] 图2是获得的转基因拟南芥的⑶S染色图。
[0019] 图3是转基因拟南芥与野生型拟南芥的抗重金属表型图。
【具体实施方式】
[0020] 以下结合附图详细描述本发明的技术方案。应当说明的是，所述实施例仅用以说 明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的 普通技术人员应当理解，可以对发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明 技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围中。
[0021] 本发明所用的试验材料及其来源包括： 野生型拟南芥)生态型拟南芥，23 °C人工气候室培 养，16 h光照培养。
[0022] 克隆载体pMD-18-Simple T、各类限制性内切酶、Taq聚合酶、连接酶、dNTP、 10XPCR buffer和DNA marker购自宝生物工程大连有限公司。所有的化学试剂都从美国 西格玛化学公司和上海国药化学试剂购买。ABI PRIAM Big-Dye Terminator DNA测序试剂 盒购自美国应用系统公司。
[0023] 本发明所用的试剂若未明确指明，则均购自西格玛一奥德里奇（Sigma - Aldrich)。
[0024] 本发明涉及分子生物学实验，如没有特别注明，均参考自《分子克隆》一书（J.萨 姆布鲁克、E.F.弗里奇、T.曼尼阿蒂斯著，1994,科学出版社)。
[0025] 实施例1 扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因的人工合成 根据Genbank登录的扭脱甲基杆菌基因序列，用以基因合成方法【Nucleic Acids Research, 2004，32，e98】，在不改变基因编码的氨基酸序列的前提下，按以下原 则进行合成基因编码区的设计：（一）优化基因密码子，提高基因翻译效率。（二）消除基因 内部的常用限制性内切酶的识别位点，便于表达盒构建。（三)消除逆向重复序列、茎环结构 和转录终止信号，使基因内部的GC/AT均衡，提高RNA的稳定性。（四)使基因编码蛋白符合 N端原则（Tobias 1991)，以提商翻译蛋白的稳定性。（五)设计提商基因5'端的自由能，以 提商基因翻译起始效率。
[0026] 扩增条件为：94°C 预热 1 min ;94°C，30 s，50°C，30 s，72°C，2 min，使用的 Taq DNA聚合酶为KOD FX taq酶（Toyobo公司，日本)，共25个循环。
[0027] PCR结束后，1%琼脂糖胶回收，取10 μ?直接与T/A克隆载体相连(大连宝生物 公司）。4°C连接过夜，高效转化DH5 α感受态中。获得阳性克隆。
[0028] 实施例2 农杆菌双元载体的构建 上述人工合成的基因的阳性克隆用引物经PCR扩增后头尾分别加入Bam HI和 Sac I切点，经Bam HI + Sac I双酶切，回收DNA片段与相应酶切的载体相连，经酶切鉴定 和测序后得到正确的双元载体(见图1)。
[0029] 实施例3 电击法转化农杆菌 1)制备农杆菌 GV3101 感受态，方法参照 MicroPulser? Electroporation Apparatus Operating Instructions and Application Guide (BIO-RAD 公司）((Raineri et al., Bio. Tech·, 1990， 8: 33-38)。
[0030] 2)取5(^1^￥3101感受态细胞，加入1以1^離，转入0.2〇11电击杯转化（40(^， 2. 5KV，25y f)。加入1 mL含有1%甘露醇的LB培养基恢复培养2小时（28°C，250rpm)。分 别取10 μ L、100 μ L涂LB平板(利福平50 μ g/mL，庆大霉素50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL)。
[0031] 3)挑取几个克隆，碱法抽提农杆菌质粒，酶切鉴定，PCR检测。
[0032] 实施例4 农杆菌介导转化拟南芥 A拟南芥的培养 1)拟南芥种子在4°C进行2 - 3天的春化处理，目的是有利于种子的一致萌发和花期 的提前。
[0033] 2)将蛭石、黑土、珍珠岩按9 :3 :0. 5的比例拌勻，经高温灭菌后装于10cm的塑料 小盆，以营养液PNS浸湿待用。
[0034] 3)以牙签将拟南芥种子点播于湿润的基质上，保鲜膜封口。放置于22°C暗培养 2 - 3天，待种子萌发后，揭开保鲜膜，置于22°C培养室中进行16小时光照培养。
[0035] 4)拟南芥抽苔后及抽苔后两周以及转化后需再以PNS营养液浸湿一次。中途可视 情况适当浇水。首次抽苔后需剪去初生苔，利于次生苔的生长，当次生苔长至2 - 10cm(少 数已经开花）可用于转化(何玉科，巩振辉，细跑生物学杂志，1991，13(3) :97-101 )。
[0036] B农杆菌的准备 1)挑取农杆菌单菌接种于5mL LB液体培养基(利福平50 μ g/mL，氯霉素100 μ g/mL) 中，28°C，250rpm 培养 20 小时（Rashid et al·，1996)。
[0037] 2)取lmL菌液转接入20 - 30mL LB液体培养基(利福平50μ g/mL，氯霉素100μ g/ mL)中，28°C，250rpm 培养约 12 小时，测 0D600 ?1· 5。
[0038] 3) 8000rpm，4°C，lOmin离心收集菌体，重悬于农杆菌转化渗透液（5%鹿糖，0· 05% Silwet L-77)并稀释至 0D600 ?0· 8。
[0039] C拟南芥蘸花法转化 1)将拟南芥的花苔浸入渗透液中，轻轻搅动约3?5秒后取出，全部转化完毕后，托盘 中加入PNS营养液，以黑色塑料袋套盆封口，保持湿润环境，置于22°C培养室低光强度下生 长24小时，即可正常培养。
[0040] 2)初次转化四天后，可再进行一次转化，重复两次，总共转化三次，这样可以在花 发育的不同时期进行转化，提高转化效率。
[0041] 3)生长约两个月后，收集种子，4°C冰箱贮存待用。
[0042] 实施例5 拟南芥转化植株种子的筛选 1)称25 - 30mg种子放入1. 5mL离心管。
[0043] 2) lmL 75%乙醇消毒lmin (不停摇晃振荡），8000rpm离心5秒，去上清。
[0044] 3)加入lmL过滤后的漂白粉消毒15min (不停摇晃振荡，充分消毒），8000rpm离 心5秒，去上清。
[0045] 4)无菌水洗涤3 - 4次。
[0046] 5)将种子均匀的播撒到1/2MS平板（Hyg 50yg/mL)上，Parafilm膜封口，4°C冰 箱放置两天，22°C，16小时光照培养6天。
[0047] 6)将抗性植株移栽到盆中培养，苗稍大后，进行GUS活性检测，选出阳性植株（ΤΙ) 继续培养，并收集种子进行Τ2代和Τ3代筛选。
[0048] 实施例6 转基因阳性植株的检测 按Jefferson (1978)的方法，将待测拟南芥叶片样品与X-Gluc染色反应液（50m mol/ L NaH2P04，pH7.0 ;0· 5m mol/L K4[Fe(CN)6]，0.1% Triton X-100,20% 甲醇，0.5mg/mL X-Gluc [X-glucuronide])于37°C保温2 - 4小时后，用75%乙醇脱色观察(见图2)。
[0049] 实施例7 扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白ife/M炉基因转化植物后的抗重金属分析 将转化植物自交纯合3代，获得纯合转化株，收取种子。播种后，在22°C生长两个星 期。然后比较了转基因的拟南芥植株和野生型拟南芥植株的抗重金属性。结果表 明，野生型和转基因拟南芥植株在表型上有很大的差异。结果显示在50〇μΜ浓度 的氯化铬浓度培养基处理下野生型生长明显受抑制，根系不生长，叶片稀少，而转基因株系 抑制较小。结果说明基因明显提高了拟南芥的抗重金属能力（图3)。 附：本申请中所涉及到的核苷酸序列表： 〈11〇>南京博欧生物科技有限公司 〈120> -种来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白基因及其抗重金属应用 <141> 2012-12-8 <160> 2 <210> SEQ ID No 1 <211> 234 <212> DNA 〈213> 扭脱甲基杆菌（mex-Methylobacterium extorquens) <220> 〈223> n =a 或 g 或 c 或 t 〈400> ORIGIN 1 ggatccatgg atcagtctcc aatcgaactt actatgagag ttgatggtat 51 gacttgtgaa ggttgtgctg aagctgtcag aagaaccatc agaagacttg 101 atccacaagc tgacgtctct gttgatgttg gtcttggcag agtctctgct 151 actactgttg ctcagtctct ggatgttgct caagctctga ctcaagctgg 201 ctatactgct actgctatga ctggctaaga gctc // 〈210〉 SEQ ID No 2 〈211〉 73 〈212〉 PRT 〈213> 扭脱甲基杆菌（mex-Methylobacterium extorquens) 〈400〉 ORIGIN 1 MDQSPIELTM RVDGMTCEGC AEAVRRTIRR LDPQADVSVD VGLGRVSATT 51 VAQSLDVAQA LTQAGYTATA MTG- //
【权利要求】
1. 一种来源于扭脱甲基杆菌的根据植物偏爱人工合成的重金属结合蛋白基因，其特征 在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2. 根据权利要求1所述的来源于扭脱甲基杆菌的重金属结合蛋白，其特征在于，其氨 基酸序列如SEQ ID NO 2所示。
3. 权利要求1或2所述的重金属结合蛋白采用人工方法制备而成。
4. 权利要求1或2所述的重金属结合蛋白采用农杆菌蘸花法转化拟南芥。
5. 权利要求1或2所述的重金属结合蛋白转基因植物在抗重金属中的应用。
【文档编号】C12R1/01GK104099347SQ201310124783
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2013年4月11日
【发明者】薛永, 蒋小辉, 徐小赟, 侯晓光, 吴顺霞, 侯曙光, 周惠, 伍光彩, 张扬 申请人:南京博欧生物科技有限公司