专利名称：来自食甲基嗜甲基菌的新的酶及其编码基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物技术，具体地说是3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶，预苯酸脱水酶和所述酶的编码基因。所述基因用于提高芳香族氨基酸的产量。
背景技术：
通常工业上用短杆菌属，棒杆菌属，芽孢杆菌属，埃希氏菌属，链霉菌属，假单胞菌属，节杆菌属，沙雷氏菌属，青霉属假丝酵母属的微生物通过发酵的方法生产L-氨基酸。对于这些微生物，可利用从这些微生物的天然或突变体分离的菌株提高氨基酸的产量。此外，已公开了多种重组DNA技术通过增强L-氨基酸生物合成途径中的酶的活性来提高L-氨基酸的产量。
尽管可以利用上述微生物进行育种或改良生产工艺来提高氨基酸的产量，但仍需开发更加廉价高效的L-氨基酸生产工艺来满足对L-氨基酸日益增长的需求。
按照惯例，已知以能大批量并廉价获得的甲醇作为原料，利用以下属的细菌发酵生产氨基酸拟无枝酸菌属和假单胞菌属(参见日本专利公开No.45-25273)、精朊杆菌属(参见日本专利公开No.49-125590)、精朊杆菌属和甲烷单胞菌属(参见日本专利公开No.50-25790)，微环菌属(参见日本专利公开No.52-18886)，甲基菌属(参见日本专利公开No.4-91793)和芽孢杆菌属(参见日本专利公开No.3-505284)。
此外，有几种酶在芳香族化合物，如L-苯丙氨酸，L-酪氨酸和L-色氨酸的生物合成途径中起重要作用。所述的关键酶是3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(以下缩写为″DS″)。对于L-苯丙氨酸的生物合成，预苯酸脱水酶(以下缩写为″PD″)也是关键酶。
但嗜甲基菌属中编码DS和PD的任何基因都是未知的。
发明内容
本发明的一个目的是提供属于食甲基属的细菌的编码DS和PD的基因。
为达到上述目的本发明人进行了深入的研究。结果利用分支酸变位酶-预苯酸脱水酶基因(pheA)缺陷的大肠杆菌菌株，从食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)中成功地分离了DS和PD的编码基因，从而完成了本发明。
本发明提供(1)由下述(A)或(B)所定义的蛋白(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-synthase)合酶活性的蛋白。
(2)编码由下述(A)或(B)所定义的蛋白的DNA(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯(3-deoxy-D-arabinoheptulosonate-7-synthase)合酶活性的蛋白。
(3)如(2)中所述的DNA，该DNA是下述(A)或(B)定义的DNA(A)包含如SEQ ID NO1所述核苷酸序列的DNA；或(B)可与如SEQ IDNO1所述的核苷酸序列或由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA。
(4)如(3)所述的DNA，其中，所述的严格条件是在60℃，相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
(5)由下述(C)或(D)所定义的蛋白(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白。
(6)编码由下述(C)或(D)所定义的蛋白的DNA(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白。
(7)如(6)中所述的DNA，该DNA是由下述(C)或(D)定义的DNA(C)包含如SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA；或(D)可与如SEQ IDNO3所述的核苷酸序列或由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白的DNA。
(8)如(3)所述的DNA，所述的严格条件是在60℃，相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
本发明中，术语″3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性″是指催化由磷酸烯醇式丙酮酸和D-赤藓糖-4-磷酸酯合成3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯的活性。术语″预苯酸脱水酶活性″是指催化由预苯酸合成苯丙酮酸的活性，术语″分支酸变位酶″是指催化由分支酸合成预苯酸的活性。这表明与其他微生物，如大肠杆菌一样，本发明所述的PD具有分支酸变位酶活性及预苯酸脱水酶活性。本发明中，术语″至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一″指PD具有一种或两种性质。因此，在本发明中，″至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一″可以指″PD活性″。
下面对本发明进行详细描述。
本发明的DNA可以来自下述食甲基嗜甲基菌的染色体DNA。
制备食甲基嗜甲基菌，例如食甲基嗜甲基菌菌株AS-1的染色体DNA。所述的染色体DNA可通过例如Saito和Miura(Biochem.Biophys.Acta.，72，619(1963))，或K.S.Kirby(Biochem.J.，64，405(1956))中所述的方法从细胞团中获得。
然后，为从所获得的染色体DNA中分离DS或PD基因，制备染色体DNA文库。首先用合适的限制酶将上述染色体DNA部分消化以获得多种片段的混合物。可以使用多种限制酶，条件是可以通过控制酶切反应时间等条件等控制酶切程度。例如，可用Sau3AI或BamHI在不低于30℃，优选地在37℃，以酶浓度1-10单位/ml在不同时间段(1min到2h)作用于所述的染色体DNA，对其进行消化。
接下来收获DNA片段与可在埃希氏属的细菌中自我复制的载体DNA相连制备重组DNA。具体地说，用限制酶在温度不低于30℃、1-100单位/ml酶浓度的条件下作用于载体DNA 1h以上，优选1-3小时以将所述载体完全消化、切割、裂解，所述的限制酶，如BamHI产生的末端核苷酸序列与用Sau3AI切割染色体DNA所产生的末端核苷酸序列互补。接下来将上述获得的染色体DNA片段混合物与经裂解切割的载体DNA片段混合，使1-100单位/ml浓度的DNA连接酶优选T4 DNA连接酶在4-16℃下作用于所述混合物不少于1h，优选4-24h，以获得重组DNA。
用所得的重组DNA转化埃希氏属的微生物，如大肠杆菌B-7078(pheA::Tn10(KmR))。将转化子涂布于不含苯丙氨酸的琼脂平板上，将所得的克隆接种于液体培养基中培养。从培养细胞中回收质粒以获得含PD基因的DNA片段。
通过测序确定由上述步骤获得的DNA片段是否含有PD基因，并证实所确定的序列包含SEQ ID NO3中所述的序列。
通过片段测序和下述事实证明了，在下述实施例中获得的含PD基因的克隆片段也含有DS基因，所述事实为该片段互补于DS-缺陷的芳香营养缺陷菌株AB3257(aroG 365-，aroH367-，aroF363-，thi-1，ilvC7，argE3，his-4，proA2，xyl-5 galK2，lacY1，mtl-1，strA712，tfr3，tsx-358，supE44，hsdR2，zjj-202::Tn10)。
当用BamHI消化食甲基嗜甲基菌菌株AS-1的染色体DNA时，DS和PD基因克隆为约10Kb的BamHI片段。
利用上述方法可从其他食甲基菌属的细菌中分离出DS和PD基因。另外，由于本发明DNA的核苷酸序列已阐明，可以利用基于确定序列合成的寡核苷酸作为引物的PCR(聚合酶链式反应)或利用上述寡核苷酸为探针的杂交方法从嗜甲基菌属细菌的染色体DNA或基因组文库中获得DNA。
可利用本领域技术人员已知的常规方法制备基因组DNA、制备基因DNA文库，进行杂交，PCR，制备质粒DNA，进行DNA的消化、连接和转化。上述操作参见Sambrook，J.，Fritsch，E.F.，和Maniatis，T.，″Molecular Cloning A Laboratory Manua l，Second Edition″，Cold Spring Harbor Laboratory Press，(1989)。
上述获得的DS基因的核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO1中所示。另外，由核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
上述获得的PD基因核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO3中所示。另外，由核苷酸序列编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO4所示。
本发明的DNA可编码包含在一个或多个位点取代、缺失、插入、添加或倒转一个或多个氨基酸的DS或PD，条件是所编码的DS或PD的活性不发生改变。“几个”氨基酸的数量依所述蛋白三维结构中的氨基酸残基的位置或类型的不同而不同。原因如下，即一些氨基酸如异亮氨酸和缬氨酸彼此间高度同源。这样的氨基酸之间的差异不会显著地影响蛋白的三维结构。因此，由本发明的DNA编码的蛋白可以是与构成DS或PD的全部氨基酸残基同源性不小于35-50％，优选50-70％同源，且具有DS和PD活性的蛋白。更适当地，所谓″几个″氨基酸是2到30，优选2到20，更优选2到10个。
编码与上述DS或PD基本相同的蛋白的DNA可通过下述方法对核苷酸序列进行修饰而获得，即通过例如定点诱变方法使得特定位点的一个或多个氨基酸残基发生取代，缺失，插入，添加或倒转。诱变处理包括在体外处理编码DS和PD的DNA的方法，例如用羟胺处理，处理微生物的方法，例如用紫外线或诱变剂如，常用于诱变处理的N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍(NTG)和亚硝酸处理带有编码DS和PD的DNA的埃希氏属细菌。
上述核苷酸的取代，缺失，插入，添加，或倒转还包括天然存在的突变(突变体或变异体)，例如基于带有DS和PD的微生物的个体差异或种或属差异的突变。
可以通过在合适的细胞中表达带有上述突变的DNA，再检验表达产物的DS和PD活性，由此获得编码与DS和PD基本上相同的蛋白的DNA。也可以从编码带有突变DS和PD的DNA或从带有所述DNA的细胞中分离可与，例如序列表中SEQ ID NO1所述序列在严格条件下杂交并编码具有DS和PD活性的蛋白的DNA，由此获得编码与DS和PD基本上相同的蛋白的DNA。所述的“严格条件”是指一种形成特异性杂交而不形成非特异性杂交的条件。用任何数值都难以清楚地表达这一条件。但举例来说，所述严格条件包括高同源性的DNA，如同源性高于50％的DNA之间可以彼此杂交，而同源性低于上述数值的DNA间不能杂交的条件。或者，作为示例，所述严格条件是指在相当于Southern杂交普通洗涤条件的盐浓度下使所述DNA彼此杂交，即60℃，1×SSC，0.1％SDS，优选0.1×SSC，0.1％SDS。
可在上述的条件下杂交的基因包括那些具有在所述基因的编码区产生的终止密码子的基因和那些由于在活性中心发生突变而没有活性的基因。但这些突变可通过下述方式轻易地排除，即将所述基因与可商购的活性表达载体相连，再按上述方法测定DS和PD的活性。
举例来说，用于表达DS或PD基因的宿主例如埃希氏属的细菌，如大肠杆菌；棒状细菌，如乳发酵短杆菌；嗜甲基菌属的细菌，如食甲基嗜甲基菌；和多种真核细胞，如酿酒酵母；动物细胞和植物细胞，优选原核细胞，特别是大肠杆菌，棒状细菌和食甲基嗜甲基菌。
将DS或PD基因引入大肠杆菌细胞的载体包括，例如pUC19，pUC18，pBR322，pHSG299，pHSG399，pHSG398，RSF1010，pMW119，pMW118，pMW219和pMW218。也可以用噬菌体DNA载体。
用于将DS或PD引入棒状细菌的载体包括，例如pAM330(参见日本专利公开No.58-67699)，pHM1519(参见日本专利公开No.58-77895)，pAJ655，pAJ611和pAJ1844(参见日本专利公开No.58-192900)，pCG1(参见日本专利公开No.57-134500)，pCG2(参见日本专利公开No.58-35197)，pCG4和pCG11(参见日本专利公开No.57-183799)，pHK4(参见日本专利公开No.5-7491)。
用将DS或PD连到上述的载体中形成的重组载体转化上述宿主将DS和PD引入其中。所述的DS或PD基因可通过转导、转座(Berg，D.E.and Berg，C.M.，Bio/Technol.，1，417(1983))，Mu噬菌体(Japanese Laid Open Patent Publication No.2-109985)或同源重组(Experiments in Molecular Genetics，Cold Spring HarborLab.(1972))的方法整合到宿主细胞的基因组中。
可通过下述方式产生DS和PD，即培养按上述方法引入了DS或PD基因的细胞，在培养基中产生并积累DS或PD，从培养物中收集DS或PD。培养所选用的培养基应当是适合于宿主的培养基。
需要时可利用通常的酶纯化方法，如离子交换层析，凝胶过滤层析，吸附层析，溶剂沉淀等从细胞抽提物或培养基中纯化按上述方法产生的DS或PD。
可用本发明的DNA构建带有其活性高于野生型的DS或PD。这可通过用包含可表达形式的DS或PD基因的载体转化微生物实现。
用于本发明的细菌包括，例如食甲基嗜甲基菌AS1(NCIMB10515)等。可从英国国家工业和海洋细菌保藏中心，NCIMB Lts.，Torry研究站135，Abbey Road，Aberdeen AB9 8DG，获得食甲基嗜甲基菌AS1(NCIMB10515)。
为提高芳香氨基酸，特别是L-苯丙氨酸的产量，扩增编码DS和PD酶的基因是有益的。
图1表示带有DS和PD基因的质粒pPD1和pPD2的构建图2表示带有PD和DS基因，缺失了食甲基嗜甲基菌DNA片段后所得质粒的互补分析。
实施本发明的最佳方式在鸟枪实验中通过互补，将带有食甲基嗜甲基菌预苯酸脱水酶和DAHP-合酶基因的10kbp BamHI DNA片段克隆到低拷贝载体pMW119(ApR)中(图1)。在这一实验中用BamHI消化食甲基嗜甲基菌AS-1的染色体DNA，用T4 DNA连接酶将所得的DNA片段与质粒pMW119的BamHI消化产物连接。用所述连接产物转化大肠杆菌B7078(pheA::Tn10(KmR))。在所得的抗氨苄青霉素克隆中选择苯丙氨酸营养缺陷型消失的菌株，并从中回收质粒。将所得的质粒之一命名为pPD1。将带有与pPD1中克隆片段方向相反的片段的质粒命名为pPD2。
互补于原养型的质粒pPD1和pPD2不仅是大肠杆菌B7078的pheA-突变体还有DS-大肠杆菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)。由此推定质粒pPD1和pPD2都带有在同一克隆的DNA片段中的编码PD酶和DS酶的基因。
构建pPD1和pPD2的缺失衍生物(图2)。所述的缺失是通过在体外用不同的限制酶消化质粒DNA再连接所得的DNA片段获得的。用所得的连接混合物转化PD-菌株大肠杆菌B-7078(pheA::Tn10(kan))成为Phe+原养型。对分离的质粒作图并测定其互补DS-突变体大肠杆菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)成为Aro+原养型的能力。所构建的缺失衍生物在结构和互补能力方面有所不同。发现了只带有一个PD酶编码基因的缺失衍生物。这些缺失衍生物丧失了互补DS-突变体大肠杆菌AB3257(aroG-，aroH-，aroF-)为原养型的能力。因此，推测在pPD1或pPD2中克隆的食甲基嗜甲基菌DNA片段带有分别编码DS和PD酶的两个不同基因。
确定了编码DS和PD酶的两个食甲基嗜甲基菌基因的核苷酸序列。DS基因的核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQID NO1所示。PD基因的核苷酸序列和由该核苷酸序列编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。
通过计算机程序分析并表征了编码DS和PD酶的食甲基嗜甲基菌基因的核苷酸序列。DS和PD基因序列翻译后与许多其他微生物中的相同功能的蛋白表现出明显的氨基酸序列相似性(表1，2)。
工业实用性本发明提供了3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶，预苯酸脱水酶和该酶的编码基因。该基因可用于提高芳香族氨基酸的产量。
表1食甲基嗜甲基菌DS酶蛋白序列与其他微生物中类似序列的比对
表2食甲基嗜甲基菌PD酶蛋白序列与其他微生物中类似序列的对比
序列表序列表<110>味之素株式会社<120>来自食甲基嗜甲基菌的新的酶及其编码基因<130>B886MSOP1086<141>2001-11-13<150>RU 2000128122<151>2000-11-13<160>4<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>1083<212>DNA<213>食甲基嗜甲基菌(Methylophilus methylotrophus)<220>
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1.一种由下述(A)或(B)所定义的蛋白(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白。
2.编码由下述(A)或(B)所定义的蛋白的DNA(A)包含SEQ ID NO2所述氨基酸序列的蛋白；或(B)包含在SEQ ID NO2所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白。
3.如权利要求2所述的DNA，该DNA是下述(A)或(B)所定义的DNA(A)包含如SEQ ID NO1所述核苷酸序列的DNA；或(B)可与如SEQ ID NO1所述的核苷酸序列或由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码具有3-脱氧-D-阿糖庚酮糖酯-7-磷酸酯合酶活性的蛋白的DNA。
4.如权利要求3所述的DNA，其中，所述的严格条件是在60℃，相当于1×SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
5.一种由下述(C)或(D)所定义的蛋白(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白。
6.编码由下述(C)或(D)所定义的蛋白的DNA(C)包含SEQ ID NO4所述氨基酸序列的蛋白；或(D)包含在SEQ ID NO4所述氨基酸序列中含有一个或多个氨基酸缺失，取代，插入或添加的氨基酸序列且至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白。
7.如权利要求6所述的DNA，该DNA是下述(C)或(D)所定义的DNA(C)包含如SEQ ID NO3所述核苷酸序列的DNA；或(D)可与如SEQ ID NO3所述的核苷酸序列或由该序列制备的探针在严格条件下杂交，且编码至少具有预苯酸脱水酶活性或分支酸变位酶活性之一的蛋白的DNA。
8.如权利要求7所述的DNA，其中，所述的严格条件是在60℃，相当于1x SSC和0.1％SDS的盐浓度下进行洗涤的条件。
全文摘要
本发明提供来自食甲基嗜甲基菌的新的3－脱氧－D－阿糖庚酮糖酯－7－磷酸酯合酶和预苯酸脱水酶/分支酸变位酶，以及编码所述酶的DNA。
文档编号C12N9/90GK1527881SQ01821748
公开日2004年9月8日 申请日期2001年11月13日 优先权日2000年11月13日
发明者Y·A·V·伊奥曼塔斯, E·G·阿巴拉基纳, 臼田佳弘, 西尾阳介, N·V·戈斯科瓦, Y A V 伊奥曼塔斯, 介, 弘, 戈斯科瓦, 阿巴拉基纳 申请人:味之素株式会社