一种唾液乳杆菌及其应用及胞外多糖及其制备方法和应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种唾液乳杆菌（Lactobacillus?salivarius），其特征在于，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC?No.6278。还公开了该唾液乳杆菌在发酵产生胞外多糖中的应用。还公开了一种发酵产胞外多糖的方法，其特征在于，该方法包括在生成胞外多糖的条件下，将如上所述的唾液乳杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。本发明还公开了如上所述的方法制备的胞外多糖及其在制备免疫调节剂中的应用。本发明提供的唾液乳杆菌能够产生胞外多糖，并且该多糖具有良好的促进NK细胞活性的功能。
【专利说明】一种唾液乳杆菌及其应用及胞外多糖及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)及该唾液乳杆菌在发 酵产生胞外多糖中的应用，以及采用该唾液乳杆菌发酵产生胞外多糖的方法，采用该方法 制备的胞外多糖及其应用。
【背景技术】
[0002] 胞外多糖（exopolysaccharide，EPS)是微生物在生长代谢过程中分泌到细胞外的 一类糖化合物，是微生物适应环境的产物，对菌体有保护作用，包括维持适度的水分，吸取 金属离子，抑制溶菌酶以及预防噬菌体的侵染等作用。还可以稳定渗透压、支持细胞结构、 参与细胞信息传递和细胞构成等。多糖类化合物作为生命物质的主要成分之一，广泛参与 了细胞的各种生命现象及生理过程的调节。多糖及其缀合物既是通讯的信号分子，如抗原 决定簇、受体分子上的接受者(激素受体、毒素受体）以及生物活性物质有关的信息携带者 等，又是细胞间的识别分子，如细胞粘着，病原体与寄主的作用等。大量药物及临床研究结 果表明，多糖类化合物是一种免疫调节剂，能激活免疫受体，提高机体的免疫功能，在癌症 的辅助治疗中，具有细胞毒性小，安全性高，抑瘤作用好等优点。
【发明内容】
[0003] 本发明的目的是提供一种唾液乳杆菌及其应用，及发酵产生胞外多糖的方法，以 及利用该方法制备的胞外多糖及其应用。
[0004] 为了实现上述目的，一方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)，其中，所述唾液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No. 6278。
[0005] 另一方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌在发酵产生胞外多糖中的应用。
[0006] 第三方面，本发明提供了一种发酵产生胞外多糖的方法，其中，所述方法包括在生 成胞外多糖的条件下，将如上所述的唾液乳杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵 液。
[0007] 优选地，以每100mL发酵培养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为 1 X 107-9X 109CFU。
[0008] 优选地，所述发酵的条件包括：温度为25_43°C，起始pH值为5. 5-7. 5,发酵周期为 20-30小时。
[0009] 优选地，所述发酵培养基中还含有果糖、黄嘌呤、对氨基苯甲酸、叶酸、尼克酸和 泛酸钙，进一步优选地，以每升发酵培养基为基准，果糖的用量为25-35g，黄嘌呤的用量为 0· 02-0. 05g，对氨基苯甲酸的用量为0· 0003-0. 0008g，叶酸的用量为0· 0003-0. 0008g，尼 克酸的用量为〇. 001-0. 〇〇4g，泛酸钙的用量为0. 001-0. 004g。
[0010] 本发明的唾液乳杆菌具有较强的产胞外多糖的能力。采用本发明优选的发酵条件 和优选的培养基，可进一步提高胞外多糖的产量。并且本发明提供的胞外多糖具有较好的 免疫调节的作用。 toon] 本发明的其他特征和优点将在随后的【具体实施方式】部分予以详细说明。
[0012] 生物保藏
[0013] 本发明提供的菌株被命名为唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)，并于2012 年6月25日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳 区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为 CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No. 6278。
【具体实施方式】
[0014] 以下对本发明的【具体实施方式】进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体 实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
[0015] -方面，本发明提供了一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)，其中，该唾 液乳杆菌的保藏编号为CGMCC No. 6278。
[0016] 另一方面，本发明提供了如上所述的唾液乳杆菌在发酵产生胞外多糖中的应用。
[0017] 第三方面，本发明提供了一种发酵产生胞外多糖的方法，其中，该方法包括在生成 胞外多糖的条件下，将如上所述的唾液乳杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
[0018] 发酵过程就其本质来说是由微生物参与的生物化学反应过程，因此微生物细胞的 数量、状态、代谢情况对产物的生物合成有着重要的影响。菌体浓度的大小对发酵产物的产 率有着重要的影响。理论上菌体浓度越大，产物的产量也越大，但是菌体浓度过高会产生 其他影响，如营养物质消耗过快，发酵液中的营养成分发生明显的改变，如有毒物质的积累 等，这些可能改变菌体的代谢途径。因此，本发明中，以每100mL发酵培养基为基准，唾液乳 杆菌的接种量优选为1X 1〇7_9 X 109CFU，进一步优选为3 X 108-9 X 109CFU。
[0019] CFU (Colony-Forming Units,菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由 单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单 位，以其表达活菌的数量。
[0020] 由于本发明在于提供了一种能够产生胞外多糖的唾液乳杆菌，因此，在产生胞外 多糖的发酵过程中只要在发酵培养基中接种本发明提供的唾液乳杆菌即可实现本发明的 目的。对于发酵的条件和工艺无特殊要求，可以采用本领域常用的发酵条件和工艺，例如， 温度为18_45°C，起始pH值为5-8。为了提高所述唾液乳杆菌的胞外多糖产量，优选情况下， 发酵的条件包括：温度为25-43°C，起始pH值为6-7. 5。
[0021] 其中，对发酵的周期没有特别的限制，只要保证所述唾液乳杆菌能够产生胞外多 糖即可，综合考虑胞外多糖的产量和时间因素，优选地，所述发酵的周期为20-30小时。
[0022] 本发明提供的唾液乳杆菌为兼性厌氧菌，因此，所述发酵可以在好养的条件下进 行，也可以在厌氧的条件下进行。本发明的发明人发现，在厌氧发酵或是好养发酵的情况 下，其产胞外多糖的量无显著性的差异。综合成本考虑，本发明优选在好养的条件下进行发 酵。所谓"在好养的条件下进行发酵"是指在发酵的过程中不对发酵罐中的通气状态进行 控制，自然状态即可。
[0023] 本发明中，发酵周期是指从在发酵培养基中接种本发明的唾液乳杆菌开始至发酵 液中胞外多糖的含量开始不再变化的这段时间。
[0024] 本发明中，发酵培养基为本领域技术人员公知的概念，指微生物发酵所需的供微 生物生长和维持用的人工配制的养料，一般都含有碳水化合物、含氮物质、无机盐(包括微 量元素)、维生素和水等。发酵液也为本领域技术人员公知的概念，指接入微生物菌株的液 体培养基(该液体培养基也即本发明中所称发酵培养基)，经过一段时间的培养后所得产 物。
[0025] 根据本发明，对发酵培养基没有特别的要求，只要可以用于唾液乳杆菌发酵的发 酵培养基即可。例如，可以为本领域公知的MRS培养基(蛋白胨8-12g，牛肉膏8-12g，酵母 膏4_6g，柠檬酸氢二铵1. 8-2. 2g，葡萄糖18-22g，吐温800. 8-1. 2mL，乙酸钠 4. 5-5. 5g，磷酸 氢二钾 L 8-2. 2g，硫酸镁(λ 56-0. 6g，硫酸锰(λ 24-0. 26g，加蒸馏水至 1000mL，pH6. 2-6. 6)。
[0026] 本发明的发明人意外的发现，在用于本发明的唾液乳杆菌的发酵产胞外多糖的 发酵培养基中进一步添加果糖、黄嘌呤、对氨基苯甲酸、叶酸、尼克酸和泛酸钙可以有效的 增加胞外多糖的产量。因此，基于此发现，本发明一种优选的发酵培养基中还含有果糖、 黄嘌呤、对氨基苯甲酸、叶酸、尼克酸和泛酸钙。通过调整各物质的用量，可进一步提高胞 外多糖的产量，其中，以每升发酵培养基为基准，果糖的用量为25_35g、黄嘌呤的用量为 0· 02-0. 05g、对氨基苯甲酸的用量为0· 0003-0. 0008g、叶酸的用量为0· 0003-0. 0008g、尼 克酸的用量为〇. 001-0. 〇〇4g，泛酸钙的用量为0. 001-0. 004g。
[0027] 另外，上述优选的培养基中的基础组分可以为柠檬酸三铵、磷酸二氢钾、磷酸氢二 钾、硫酸镁、硫酸锰、硫酸亚铁、吐温80、乙酸钠、天冬氨酸、谷氨酸、丙氨酸、赖氨酸、甘氨酸、 组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨酸、苏氨酸、色氨酸、 酪氨酸、缬氨酸和半胱氨酸盐酸盐，其含量可以为本领域配制的能够用于培养唾液乳杆菌 的发酵培养基中公知的含量，在此不再赘述。
[0028] 唾液乳杆菌可以采用常规的方法接种，例如，在被接种至发酵培养基中之前，将唾 液乳杆菌经过种子培养，之后将得到的种子液加入到发酵培养基中。
[0029] 本发明中，对于种子培养的方法无特殊要求，可以采用本领域常规的方法进行培 养，此为本领域技术人员所公知，在此不再赘述。种子培养时，以l〇〇mL种子培养基为基准， 唾液乳杆菌的接种量可以为3X 108-9X 109个孢子。
[0030] 根据本发明，对于唾液乳杆菌的种子培养基没有特别的限制，可以采用本领域常 规的种子培养基。例如上述的MRS培养基。
[0031] 根据本发明，唾液乳杆菌的种子培养的条件可以在很大范围内改变，例如可以包 括：温度为35-40°C，起始pH值为6-8,时间9-15h。
[0032] 按照本发明的方法产生的胞外多糖可以用本领域常规的方法分离，例如，利用多 糖易溶于水或酸、碱溶液而不溶于醇、醚、丙酮等有机溶剂的特点，可以用乙醇沉淀法来提 取多糖，并采用透析的方法进行纯化。其具体可以为：将发酵液5800-6200g离心8-12min， 取上清液并加入2. 8-3. 2倍体积90-95体积％的2-6°C的乙醇，震荡均匀后于2-6°C下静置 20-25小时，然后7300-7600g离心18-22min，弃上清，并用蒸馏水溶解沉淀，于截留分子量 3500Da的透析袋中进行透析72小时，每6-9小时更换一次透析液，透析液为蒸馏水。
[0033] 另外，还可以根据实际需要将透析结束后的多糖溶液进行干燥得到胞外多糖干 粉，所述干燥的方法为本领域技术人员所公知，例如，冷冻干燥。
[0034] 第四方面，还提供了由本发明的方法制备的胞外多糖。
[0035] 第五方面，本发明还提供了所述胞外多糖在制备免疫调节剂中的应用。
[0036] 其中，所述免疫调节剂的种类没有特别的限制，例如，所述免疫调节剂可以包括药 物和食物。
[0037] 实施例
[0038] 以下的实施例将对本发明作进一步的说明，但并不因此限制本发明。
[0039] 1、实验菌株
[0040] 唾液乳杆菌A为本发明提供的唾液乳杆菌(该菌株于2012年6月25日被保藏在 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3 号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)(保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为 CGMCC No.6278)。
[0041] 2、试剂
[0042] 配制培养基的各组分以及配置葡萄糖标准液的葡萄糖均购自北京蓝弋化工产品 有限责任公司；小鼠淋巴细胞分离液，购自北京科百奥生物技术有限公司；hank' s液，购 自hyclone公司；RPMI1640培养基干粉，DMEM培养基干粉，均购自Gibco公司；胎牛血清 (FBS)，购自PAA公司；Triton，LDH试剂，均购自北京科百奥生物技术有限公司。
[0043] 3、实验动物Balb/c雌性小鼠 ：8周龄，SPF级，购自中国科学院遗传与发育生物学 研究所。
[0044] 4、细胞小鼠巨噬瘤细胞株RAW264. 7,小鼠淋巴瘤细胞株YAC1，均购自中国医学科 学院基础医学细胞中心。
[0045] 5、实验仪器
[0046] 分光光度计，购自UNIC0公司，型号WF2UV-2102 ;酶标仪，购自Bio-mad公司，型号 680 ;透析袋(截留分子量3500Da)，购自北京瑞达恒辉科技发展有限公司。
[0047] 6、测量方法
[0048] (1)胞外多糖产量的测定方法为3, 5-二硝基水杨酸法（DNS法）和苯酚硫酸法，具 体的：
[0049] 取0、0· 4、0· 8、1· 2、1· 6和2. Omg/mL的葡萄糖标准溶液各lmL，胞外多糖样品溶 液lmL，分别置于25mL的容量瓶中，各加入2mL的DNS溶液（6. 3g的3, 5-二硝基水杨酸和 262ml2M NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g 亚硫酸钠，冷却后定容到l〇〇〇ml)，置于沸水中蒸煮2min，然后用流水迅速冷却，用蒸馏水 定容至25mL，摇匀后于分光光度计上测定540nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，葡萄糖浓 度为横坐标，绘制标准曲线。根据胞外多糖样品的吸光度以及标准曲线计算胞外多糖样品 中还原糖的浓度。
[0050] 取 0、0· 01、0· 02、0· 03、0· 04、0· 05、0· 06、0· 07、0· 08、0· 09、0· lmg/mL 的葡萄糖标 准溶液2mL和胞外多糖样品溶液2mL。用重蒸酚配制成6体积％的苯酚溶液，每个样品中 添加1. OmL的6体积％的苯酚溶液和5. OmL的浓硫酸，摇匀，20-40°C放置30min后，使用分 光光度计于490nm波长下检测吸光度，以葡萄糖浓度为横坐标、吸光度为纵坐标绘制标准 曲线，并根据胞外多糖样品溶液的吸光度以及标准曲线计算胞外多糖样品溶液中的总糖含 量。并按下式计算EPS的含量。
[0051 ] EPS的含量=总糖含量-还原糖含量
[0052] (2)NK细胞活性测定：采用"保健食品的功能评价与开发(金宗濂，北京：中国轻工 业出版社，2001)中公开的乳酸脱氢酶（LDH)法测定NK细胞活性。
[0053] 实施例1
[0054] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0055] (1)种子培养基的配制：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g， 葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，加蒸馏水 至 1000mL，调 ρΗ6· 2-6. 6,121°C 灭菌 15min 后备用。
[0056] (2)种子培养：将唾液乳杆菌A接入步骤（1)的种子培养基中，以每100mL种子培 养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为2X10 9CFU。然后在37°C，起始pH值6.0的条件下进 行种子培养。培养12h后停止培养，得到种子液。
[0057] (3)发酵培养基的配制：称取果糖30g、黄噪呤0· 04g、对氨基苯甲酸0· 0005g、叶 酸0. 0005g、尼克酸0. 002g、泛酸钙0. 002g、柠檬酸三铵lg、磷酸二氢钾2g、磷酸氢二钾2g、 硫酸镁〇. 5g、硫酸猛0. 05g、硫酸亚铁0. 02g、吐温801mL、乙酸钠4g、天冬氨酸0. 3g、谷氨酸 〇. 3g、丙氨酸0. 2g、赖氨酸0. 2g、甘氨酸0. 2g、组氨酸0. 2g、异亮氨酸0. 2g、亮氨酸0. 2g、 赖氨酸〇. 2g、甲硫氨酸0. 2g、苯丙氨酸0. 2g、脯氨酸0. 2g、丝氨酸0. 2g、苏氨酸0. 2g、色氨 酸0· 2g、酪氨酸0· 2g、缴氨酸0· 2g和半胱氨酸盐酸盐0· 5g，加蒸馈水至lOOOmL，调ρΗ6· 5， 121°C灭菌15min后备用。
[0058] (4)发酵：将步骤（2)的种子液接入步骤（3)的发酵培养基中，以每100mL的发酵 培养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为5 X 109CFU，在42°C，调节起始pH值至6. 5的条件下 进行发酵，发酵24小时，得到含有胞外多糖的发酵液。
[0059] (5)胞外多糖的提取：将步骤（4)中得到的发酵液在6000g下离心10min，取上清 液并加入3倍体积95体积％的4°C的乙醇，震荡均匀后于4°C下静置24小时，然后在7500g 离心20min，弃上清，并用10mL蒸馈水溶解沉淀，于截留分子量3500Da的透析袋中在蒸馈水 中进行透析72小时，每8小时更换一次蒸馏水，得到胞外多糖溶液。并测定胞外多糖的产 量为 23. 54mg/L。
[0060] 实施例2
[0061] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0062] (1)种子培养基的配制：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g， 葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，加蒸馏水 至 1000mL，调 ρΗ6· 2-6. 6,121°C 灭菌 15min 后备用。
[0063] (2)种子培养：将唾液乳杆菌A接入步骤（1)的种子培养基中，以每100mL种子培 养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为3X10 8CFU。然后在40°C，起始pH值8.0的条件下进 行种子培养。培养15h后停止培养，得到种子液。
[0064] (3)发酵培养基的配制：称取果糖35g、黄噪呤0. 05g、对氨基苯甲酸0. 0003g、叶 酸0. 0008g、尼克酸0. 001g、泛酸钙0. 004g、柠檬酸三铵lg、磷酸二氢钾2g、磷酸氢二钾2g、 硫酸镁〇. 5g、硫酸猛0. 05g、硫酸亚铁0. 02g、吐温801mL、乙酸钠4g、天冬氨酸0. 3g、谷氨酸 〇. 3g、丙氨酸0. 2g、赖氨酸0. 2g、甘氨酸0. 2g、组氨酸0. 2g、异亮氨酸0. 2g、亮氨酸0. 2g、 赖氨酸〇. 2g、甲硫氨酸0. 2g、苯丙氨酸0. 2g、脯氨酸0. 2g、丝氨酸0. 2g、苏氨酸0. 2g、色氨 酸0. 2g、酪氨酸0. 2g、缴氨酸0. 2g和半胱氨酸盐酸盐0. 5g，加蒸馈水至lOOOmL，调pH7. 5， 121°C灭菌15min后备用。
[0065] (4)发酵：将步骤（2)的种子液接入步骤（3)的发酵培养基中，以每lOOmL的发酵 培养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为3 X 108CFU，在43°C，调节起始pH值至7. 5的条件下 进行发酵，发酵20小时，得到含有胞外多糖的发酵液。
[0066] (5)胞外多糖的提取：将步骤（4)中得到的发酵液在6000g下离心lOmin，取上清 液并加入3倍体积95体积％的4°C的乙醇，震荡均匀后于4°C下静置24小时，然后在7500g 离心20min，弃上清，并用10mL蒸馈水溶解沉淀，于截留分子量3500Da的透析袋中在蒸馈水 中进行透析72小时，每8小时更换一次蒸馏水，得到胞外多糖溶液。并测定胞外多糖的产 量为 22. 53mg/L。
[0067] 实施例3
[0068] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0069] ( 1)种子培养基的配制：称取蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸氢二铵2g， 葡萄糖20g，吐温801mL，乙酸钠5g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0. 58g，硫酸锰0. 25g，加蒸馏水 至 1000mL，调 ρΗ6· 2-6. 6,121°C 灭菌 15min 后备用。
[0070] (2)种子培养：将唾液乳杆菌A接入步骤（1)的种子培养基中，以每100mL种子培 养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为9X10 9CFU。然后在35°C，起始pH值7.0的条件下进 行种子培养。培养9h后停止培养，得到种子液。
[0071] (3)发酵培养基的配制：称取果糖25g、黄嘌呤0.02g、对氨基苯甲酸0.0008g、叶 酸0. 0003g、尼克酸0. 004g、泛酸钙0. 001g、柠檬酸三铵lg、磷酸二氢钾2g、磷酸氢二钾2g、 硫酸镁〇. 5g、硫酸猛0. 05g、硫酸亚铁0. 02g、吐温801mL、乙酸钠4g、天冬氨酸0. 3g、谷氨酸 〇. 3g、丙氨酸0. 2g、赖氨酸0. 2g、甘氨酸0. 2g、组氨酸0. 2g、异亮氨酸0. 2g、亮氨酸0. 2g、 赖氨酸〇. 2g、甲硫氨酸0. 2g、苯丙氨酸0. 2g、脯氨酸0. 2g、丝氨酸0. 2g、苏氨酸0. 2g、色氨 酸0. 2g、酪氨酸0. 2g、缬氨酸0. 2g和半胱氨酸盐酸盐0. 5g，加蒸馏水至1000mL，调pH6. 0， 121°C灭菌15min后备用。
[0072] (4)发酵：将步骤（2)的种子液接入步骤（3)的发酵培养基中，以每100mL的发酵 培养基为基准，唾液乳杆菌的接种量为9 X 109CFU，在25°C，调节起始pH值至6. 0的条件下 进行发酵，发酵30小时，得到含有胞外多糖的发酵液。
[0073] (5)胞外多糖的提取：将步骤（4)中得到的发酵液在6000g下离心10min，取上清 液并加入3倍体积95体积％的4°C的乙醇，震荡均匀后于4°C下静置24小时，然后在7500g 离心20min，弃上清，并用10mL蒸馈水溶解沉淀，于截留分子量3500Da的透析袋中在蒸馈水 中进行透析72小时，每8小时更换一次蒸馏水，得到胞外多糖溶液。并测定胞外多糖的产 量为 22. 33mg/L。
[0074] 实施例4
[0075] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0076] 按照实施例1的方法进行胞外多糖的发酵和制备，不同的是，发酵的温度为45°C， 胞外多糖的产量为5. 86mg/L。
[0077] 实施例5
[0078] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0079] 按照实施例1的方法进行胞外多糖的发酵和制备，不同的是，发酵的温度为18°C， 胞外多糖的产量为14. 55mg/L。
[0080] 实施例6
[0081] 本实施例用于说明本发明发酵产生胞外多糖的方法
[0082] 按照实施例1的方法进行胞外多糖的发酵和制备，不同的是，发酵的起始pH值为 5. 5,胞外多糖的产量为11. 86mg/L。
[0083] 实施例7
[0084] 按照实施例1的方法进行胞外多糖的发酵和制备，不同的是，发酵培养基中不含 有果糖、黄嘌呤、对氨基苯甲酸、叶酸、尼克酸和泛酸钙，胞外多糖的产量为6. 19mg/L。
[0085] 测试例
[0086] 本测试例说明本发明提供的唾液乳杆菌产生的胞外多糖对NK细胞活性的影响。
[0087] (1)将实施例1-7中制备的胞外多糖溶液分别配制成浓度为5 μ g/mL的胞外多糖 水溶液，备用。
[0088] (2)小鼠 NK细胞的分离与培养：将8周龄的小鼠颈椎脱臼致死，无菌条件下取其 脾脏，采用研磨法制备脾细胞，加入Hank' s液，制备成脾细胞悬浮液，浓度为5 X 106个/ mL。随后用小鼠淋巴细胞分离液经梯度离心法分离，将脾细胞悬液小心加于细胞分离液液 面之上，以2000rpm/min离心15min，收集分界面上的细胞，即得NK细胞。将所得的NK细 胞用 Hank's 液洗涤后（1500-2000rpm/min，lOmin)，重悬于 5mL RPMI1640 培养基(含 5% 的 RPMI1640培养基干粉，10%的胎牛血清）备用。
[0089] (3)小鼠巨噬细胞的培养：小鼠巨噬瘤细胞株RAW264. 7,使用DMEM培养基(含5% 的DMEM培养基干粉，10%的胎牛血清)，于37°C在C02细胞培养箱内培养，传至3代，备用。
[0090] (4) EPS直接作用于NK细胞
[0091] 实验前24小时将靶细胞(小鼠淋巴瘤细胞株YAC1，NK细胞可将其杀伤）用 RPMI1640培养基连续培养传代至3代（37°C在C02细胞培养箱)，然后用RPMI1640培养基洗 涤一次并将细胞浓度调整为1. 2X 105个/mL。将步骤（2)中得到的NK细胞用RPMI1640工 作培养基调整浓度为6. 1 X 106个/mL。在96孔板的反应孔中加入靶细胞、调整浓度的NK 细胞和步骤（1)中的胞外多糖水溶液各100 μ L;靶细胞自然释放孔加入靶细胞100 μ L，培 养基200 μ L ;靶细胞最大释放孔加入靶细胞、2. 5%Triton和培养基各100 μ L ;对照组加入 靶细胞、调整浓度后的ΝΚ细胞和培养基各100 μ L。37°C培养4h后吸取上清100 μ L于新 的培养板中，采用乳酸脱氢酶（LDH)法测定ΝΚ细胞活性。最终反应产物在酶标仪490nm处 测0D值，并根据下述公式计算反应组NK细胞的杀伤率为7. 63%，对照组NK细胞的杀伤率为 4. 97%。
[0092] NK细胞自然杀伤率计算公式：
[0093] 反应组杀伤率％=(反应组0D值-自然释放组0D值）/ (最大释放组0D值-自然 释放组0D值）X 100%
[0094] 对照组杀伤率％=(对照组0D值-自然释放组0D值）/ (最大释放组0D值-自然 释放组0D值）X 100%
[0095] (5)由巨噬细胞介导的EPS对NK细胞的作用
[0096] 按照步骤（4)中的方法测定由巨噬细胞介导的EPS对NK细胞活性的影响，不同的 是，将步骤（1)中的胞外多糖水溶液替换为EPS与小鼠巨噬细胞的共培养上清液。具体如 下：
【权利要求】
1. 一种唾液乳杆菌（Lactobacillus salivarius)，其特征在于，所述唾液乳杆菌的保 藏编号为 CGMCC No. 6278。
2. -种如权利要求1所述的唾液乳杆菌在发酵产生胞外多糖中的应用。
3. -种发酵产生胞外多糖的方法，其特征在于，该方法包括在生成胞外多糖的条件下， 将如权利要求1所述的唾液乳杆菌接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液。
4. 根据权利要求3所述的方法，其中，以每100mL发酵培养基为基准，唾液乳杆菌的接 种量为 1X107_9X109CFU。
5. 根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述发酵的条件包括：温度为25-43°C，起始 pH值为5-8,发酵周期为20-30小时。
6. 根据权利要求3或4所述的方法，其中，所述发酵培养基中还含有果糖、黄嘌呤、对氨 基苯甲酸、叶酸、尼克酸和泛酸钙。
7. 根据权利要求6所述的方法，其中，以每升发酵培养基为基准，果糖的用量为 25-35g，黄嘌呤的用量为0. 02-0. 05g，对氨基苯甲酸的用量为0. 0003-0. 0008g，叶酸的用 量为0. 0003-0. 0008g，尼克酸的用量为0. 001-0. 004g，泛酸钙的用量为0. 001-0. 004g。
8. 由权利要求3-7中任意一项所述的方法制备的胞外多糖。
9. 权利要求8所述的胞外多糖在制备免疫调节剂中的应用。
10. 根据权利要求9所述的应用，其中，所述免疫调节剂包括药物和食物。
【文档编号】C12P19/04GK104099263SQ201310125260
【公开日】2014年10月15日 申请日期:2013年4月11日 优先权日:2013年4月11日
【发明者】任发政 申请人:任发政