Cas12g在制备哺乳动物细胞RNA编辑产品中的应用

本发明涉及rna编辑，具体涉及一种cas12g在制备哺乳动物细胞rna编辑产品中的应用。

背景技术：

1、在rna编辑领域，rna干扰(rnai)技术及cas13家族是最常用的工具。rna干扰(rnainterference，rnai)是近年来生命科学领域最为重大的发现之一。它是指小分子双链rna可以特异性地降解或抑制同源mrna表达,从而抑制或关闭特定基因表达的现象。人们只要知道了某种疾病的致病基因，就可以设计出针对该基因mrna的小分子干扰rna(smallinterfering rna，sirna)，抑制或封闭该致病基因的表达，从而达到治疗疾病的目的。显然，在理论上，通过sirna几乎可以治疗所有的疾病，包括肿瘤、传染病、遗传性疾病等等，因而rnai受到学术界普遍的关注，是目前最为热门的生命科学研究领域，也是未来最有发展前途的新药开发领域。rnai可广泛应用于生命科学研究、疾病治疗和药物开发领域。除此之外，rnai技术还可以广泛应用于农业、林业、畜牧业和渔业等多种领域，进行良种培育、良种筛选和疾病治疗等。可见，rnai的应用非常广泛，具有巨大的市场发展空间。但是，由于rnai现象刚被发现不久，无论国外还是国内，目前都缺乏有效的sirna载体，这大大制约了rnai的应用，包括实验研究和药物开发。目前市场上主流的sirna转染试剂主要有：invitrogen公司的lipofectamine 2000、roche公司的x-tremegene以及上海百传公司的rfect系列产品。lipofectamine 2000是目前使用最广的小核酸转染试剂，是一款脂质体类的转染试剂，它能将sirna转染入多种体外培养的细胞株，但原代细胞、悬浮细胞的转染效果不是很好。除此之外，在使用rna干扰的过程中，会在转录组范围内观察到数百个脱靶位点，进一步限制了rna干扰在研究领域的应用。

2、与rna干扰类似，cas13酶能够敲低rna而不改变基因组，同时具有更高的on-target特异性。cas13家族具有两个高级真核生物和原核生物核苷酸结合(hepn)内切酶结构域，它们介导精确的rna切割，优先选择在生物化学和细菌中观察到的具有原间隔物侧翼位点(pfs)基序的靶向作用。迄今已鉴定出三个cas13蛋白家族：cas13a(以前称为c2c2)、cas13b和cas13c。研究者最近报道，cas13a酶可以用作核酸检测以及哺乳动物和植物细胞rna敲除和转录物追踪的工具。有趣的是，rna干扰cas13a不需要生物化学pfs。cas13酶的可编程性质使其成为开发rna结合和干扰应用工具的一个有吸引力的起点。研究者之前开发了用于哺乳动物敲除应用的lwacas13a，但它需要单体超折叠gfp(msfgfp)稳定结构域来有效敲除，尽管特异性很高，但敲除水平并不始终低于50％。

3、与其他cas13酶一样，这些cas13d同源物能独立地将crispr序列加工成向导rna。它们依赖crrna来切割目标，而不依赖hepn结构域。这些酶对目标的侧翼序列没有要求，因此可以靶向任何rna序列。既然cas13d在功能上与其他cas13酶类似，而它们独特之处在于大小；cas13d酶的平均长度为930个氨基酸，比其他cas13酶小20％，比cas9更是小33％。这种尺寸使其更容易包装到容量较小的载体中，如腺相关病毒(aav)载体。arborbiotechnologies公司的yan等人发现，rspcas13d的辅助蛋白rspwyl1增强了rspcas13d的rna靶向和降解功能。rspwyl1蛋白同时也增强了escas13d的活性，表明含有wyl结构域的蛋白可能是cas13d的活性调控元件。这种性质使得wyl蛋白成为anti-crispr蛋白的有趣对应物。salk研究所的konermann等人则发现，与核定位信号(nls)融合的casrx和admcas13d能够在哺乳动物细胞中很好地发挥功能。他们在hek293细胞中开展了mcherry报告基因检测，通过流式分析发现casrx和admcas13d分别使mcherry蛋白活性减少了92％和87％。此外，科学家还将casrx与多种rna调控方法进行比较，包括rna干扰、dcas9介导的转录抑制(crispri)以及cas13a/cas13b rna敲低。结果发现，casrx是明显的赢家，敲低效率为96％，而shrna为65％、crispri为53％，其他cas13a和cas13b大约在66-80％。此外，casrx也表现出极高的on-target效率。shrna处理产生500-900个明显的脱靶，而casrx为零脱靶。

4、cas13家族蛋白还有一种独特的活性——旁系切割(collateral cleavage)，即在crrna和靶标rna同时存在的情况下随机切割体系中其他的单链rna(ssrna)。如果将crispr-cas13系统应用于动物或人类疾病治疗时，这种不受控的、随机切割ssrna的活性就成了致命缺陷。这种缺陷使cas13家族在原核细胞或真核细胞内发挥对靶向ssrna的切割作用时，也会对非靶向rna产生切割作用，这种效应会对细胞产生一定的影响，比如会造成细胞生长缓慢、休眠，甚至引起细胞死亡。

5、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种cas12g在制备哺乳动物细胞rna编辑产品中的应用，本发明哺乳动物密码子优化的cas12g能够对哺乳动物细胞rna进行编辑，具体可以将相关转录本水平敲低至30％，相比较rfxcas13d具有较小的细胞毒性和旁切效应；且并未发现对基因组dna的脱靶情况。

2、为了实现本发明的上述目的，特采用以下技术方案：

3、本发明第一方面提供了一种cas12g在制备哺乳动物细胞rna编辑产品中的应用。

4、优选地，哺乳动物密码子优化的cas12g在制备哺乳动物细胞rna编辑产品中的应用；

5、优选地，所述哺乳动物密码子优化的cas12g至少包括seq id no:1所示的氨基酸序列。

6、优选地，表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸在制备哺乳动物细胞rna编辑产品中的应用。

7、优选地，表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸至少包括如seq id no:2所示的核苷酸序列。

8、优选地，所述产品包括重组质粒。

9、优选地，所述重组质粒包括表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸序列和载体。

10、优选地，所述载体包括腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒和溶瘤病毒。

11、优选地，所述重组质粒还包括sgrna和表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸序列有效链接的启动子；

12、所述启动子为组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、嵌合型启动子或发育特异性启动子。

13、本发明第二方面提供了一种用于哺乳动物细胞rna编辑的重组质粒，所述重组质粒包括表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸序列和载体。

14、优选地，所述重组质粒还包括sgrna和表达所述哺乳动物密码子优化的cas12g的核苷酸序列有效链接的启动子；

15、所述启动子为组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、嵌合型启动子或发育特异性启动子；

16、所述载体包括腺相关病毒、腺病毒、慢病毒、逆转录病毒、单纯孢疹病毒和溶瘤病毒；

17、所述哺乳动物细胞rna包括mrna或ncrna；

18、所述ncrna包括lncrna、mirna、misc_rna、mt_rrna、mt_trna、rrna、scarna、scrna、snorna、snrna和srna的非编码rna。

19、与现有技术相比，本发明的有益效果至少包括：

20、本发明哺乳动物密码子优化的cas12g能够对哺乳动物细胞rna进行编辑，具体可以将相关转录本水平敲低至30％，相比较rfxcas13d具有较小的细胞毒性和旁切效应；且并未发现对基因组dna的脱靶情况。

21、本发明cas12g与cas13蛋白相比的另一个优势是其大小紧凑，只有767个氨基酸，这种小尺寸有助于灵活包装成大小受限的治疗性病毒载体。