一种靶向PD-1的单克隆抗体及其应用的制作方法

本发明涉及生物制药领域，具体而言，涉及针对人pd-1的单克隆抗体及其在疾病治疗中的应用。

背景技术：

1、程序性死亡受体1(pd-1)是在t细胞、b细胞及骨髓细胞上表达的免疫抑制性受体。pd-1(由基因pdcd1编码)与ctla-4同属于cd28家族受体，其与ctla-4有23％氨基酸序列同源性(okazaki,t.&honjo,t.trends immunol.27,195–201(2006))。pd-1蛋白是55kda的i型跨膜蛋白，含有一个胞外igv区、跨膜区及胞内区，胞内区包含接近膜的免疫受体酪氨酸抑制基序(itim)和远离膜的基于酪氨酸的转换基序(itsm)(thomas，m.l.(1995)j exp med181：1953-6；vivier，e和daeron，m(1997)immunol today18：286-91)。虽然与ctla-4结构类似，但pd-1缺少结合b7-1和b7-2所必需的mypppy基序。现已鉴定了pd-1的两种配体，pd-l1和pd-l2，其显示出在结合pd-1后下调t细胞活化。pd-l1和pd-l2都是b7同源物，其与pd-1结合，但不与其它cd28家族成员结合。pd-l1在b细胞、t细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dc)上表达，但也在外周细胞(例如微血管内皮细胞)和非淋巴器官(如心脏、肺等)中表达。pd-l2仅在活化的巨噬细胞和dc中存在。另外，pd-l1和pd-l2也常常在多种肿瘤细胞中表达，通过免疫组织化学评估活组织检查业已在人的很多原发性肿瘤中发现pd-1(在肿瘤浸润淋巴细胞上)和/或pd-l1(在肿瘤细胞上)。这样的组织包括肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、皮肤癌、结肠癌、神经胶质瘤、膀胱癌、乳腺癌、肾癌、食道癌、胃癌、口腔鳞状细胞癌、尿道上皮细胞癌和胰腺癌以及头颈肿瘤。近年来研究表明阻断pd-1与其配体之间的相互作用可阻断t细胞内的负性调节信号，恢复肿瘤特异性cd8+t细胞的杀伤活性，这表明肿瘤细胞可利用pd-1/pd-l1通路逃逸免疫监视，阻断该通路有助于免疫系统清除肿瘤细胞。molecular andbiochemical aspects of the pd-1checkpoint pathway,vassiliki a.boussiotis,nejmn engl j med375；18nejm.org november 3,2016中详细综述了pd-1及相关研究。

2、目前已经公开非常多的关于pd-1/pd-l1抗体相关专利，例如pct国际申请pct/jp2006/309606公开了以高亲和力与pd-1特异性结合的分离的单克隆抗体，该专利据信与百时美施贵宝的opdivo相关。pct国际申请pct/us2008/007463披露了一种针对人程序性死亡受体pd-1的抗体，该专利据信与merck公司的keytruda相关。其他与pd-1/pd-l1抗体相关的专利可参考pct/us2009/067104，pct/cn2014/091090，pct/cn2016/102238，pct/cn2013/083467和cn201310258289.2等，在此全部引入作为参考。

3、目前，全球pd-1/pd-l1技术领域研究热点集中在四大领域：(1)联合免疫治疗，(2)联合小分子靶向药物治疗，(3)疗效预测生物标志物的检测，(4)在治疗各种高发肿瘤中的应用。其中联合小分子靶向药物和联合其他免疫检查点治疗方案的文献最多，适应症主要集中在非小细胞肺癌、膀胱癌、头颈癌、前列腺癌、胰腺癌和恶性黑色素瘤等欧美人群高发肿瘤。除用于治疗肿瘤外，抗pd-1抗体还可用于慢性病毒性感染。最近，有研究显示pd-1在来自hiv感染的个体的t细胞中高度表达。

4、自2014年9月以来，pd-1/pd-l1抗体已经被美国fda正式批准用于恶性黑色素瘤、非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、肾癌、膀胱癌、头颈部肿瘤、霍奇金淋巴瘤、宫颈癌、merkel细胞癌以及所有微卫星高度不稳定(msi-h)的实体瘤。此外，在结直肠癌、鼻咽癌、卵巢癌、前列腺癌、子宫内膜癌、胶质瘤、神经内分泌肿瘤、恶性间皮瘤、非霍奇金淋巴瘤等其他多种实体瘤临床试验中，显示出了初步的、鼓舞人心的疗效。

5、已经批准上市的pd-1/pd-l1抗体药物

6、

7、

8、目前已批准上市的pd-1/pd-l1的药物有9种，其中6款pd-1抗体为百时美施贵宝的opdivo、默沙东的keytruda，赛诺菲(sanofi)和再生元(regeneron)联合开发的libtayo、君实生物开发的特瑞普利单抗、信达生物开发的信迪利单抗和江苏恒瑞开发的卡瑞利珠单抗，3款pd-l1抗体为罗氏的tecentriq、阿斯利康的imfinzi以及默克的bavencio。这几款药物批准的适应症如上表所示。

9、在中国，6款pd-1抗体除libtayo外其余5款均获批准上市，药物之间的激烈竞争使得我国肿瘤患者在使用pd-1抗体药物的平均治疗费用低于欧美国家的费用。例如进口药物opdivo在我国的治疗肺癌适应症一年费用大约48万元，而君实生物在国内国内首家批准用于治疗晚期黑色素瘤的特瑞普利单抗将治疗费用降到约18万元。

10、即使如此，动辄几十万的药物治疗费用对于全国居民人均可支配收入28228元(2018年国家统计局数字)的国内患者人群依然是非常大的负担。尽管目前已有多种pd-1抗体已上市或正在研究中，但是提供一种与人pd-1具有更高亲和力和特异性结合的pd-1抗体，具有更好的疗效和更低价格的抗pd-1抗体仍然是临床上所急需的。

技术实现思路

0、发明概述

1、本发明提供了以高亲和力与pd-1特异性结合的分离的单克隆抗体，特别是人单克隆抗体。还提供了编码本发明抗体的核酸分子、用于表达本发明抗体的表达载体、宿主细胞和方法，以及包含本发明抗体的药用组合物。

2、本发明的另一方面涉及使用抗pd-1抗体调控免疫应答的方法，提供它们用于增强t细胞功能从而上调细胞介导的免疫应答的用途，以及治疗各种疾病，包括感染(例如急性的和慢性的)和肿瘤免疫的方法。

3、在一方面，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

4、(a)重链可变区cdr1，其包含与选自seq id no：1、seq id no：7、或seq id no：13所示一致的氨基酸序列；

5、(b)重链可变区cdr2，其包含与选自seq id no：2、seq id no：8、或seq id no：14所示一致的氨基酸序列；

6、(c)重链可变区cdr3，其包含与选自seq id no：3、seq id no：9、或seq id no：15所示一致的氨基酸序列；

7、(d)轻链可变区cdr1，其包含与选自seq id no：4、seq id no：10、或seq id no：16所示一致的氨基酸序列；

8、(e)轻链可变区cdr2，其包含与选自seq id no：5、seq id no：11、或seq id no：17所示一致的氨基酸序列；和

9、(f)轻链可变区cdr3，其包含与选自seq id no：6、seq id no：12、或seq id no：18所示一致的氨基酸序列；

10、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

11、在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区和轻链可变区的cdr序列同源性至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％。

12、在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

13、(a)重链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：1、seq id no：2和seq id no：3所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：4、seq id no：5和seq id no：6所示的氨基酸序列一致；或

14、(b)重链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：7、seq id no：8和seq id no：9所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：10、seq id no：11和seq id no：12所示的氨基酸序列一致；或

15、(c)重链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：13、seq id no：14和seq id no：15所示的氨基酸序列一致，以及轻链可变区cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分别与seq id no：16、seq id no：17和seq id no：18所示的氨基酸序列一致；

16、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

17、在又一个实施方案中，本发明提供分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含重链和轻链可变区序列：

18、(a)重链可变区，其包含与选自seq id no：19、seq id no：23或seq id no：27所示一致的氨基酸序列；

19、(b)轻链可变区，其包含与选自seq id no：21、seq id no：25或seq id no：29所示一致的氨基酸序列；

20、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

21、在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其重链可变区与选自seq id no：19、seq id no：23或seq id no：27的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性；其轻链可变区与选自seq id no：21、seq id no：25或seq id no：29的氨基酸序列具有至少为91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％的序列同源性。

22、在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体或其抗原结合部分，其包含：

23、(a)重链可变区，其氨基酸序列与seq id no：19所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与seq id no：21所示的氨基酸序列一致；或

24、(b)重链可变区，其氨基酸序列与seq id no：23所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与seq id no：25所示的氨基酸序列一致；或

25、(c)重链可变区，其氨基酸序列与seq id no：27所示的氨基酸序列一致；以及轻链可变区，其氨基酸序列与seq id no：29所示的氨基酸序列一致；

26、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

27、在另一实施方案中，所述抗体为包含人或鼠恒定区的全长抗体。又一方面，所述人恒定区选自由iggl、igg2、igg3、igg4组成的组。在又一个具体方面中，所述人恒定区是igg4。又一方面，所述鼠恒定区选自由iggl、igg2a、igg2b、igg3组成的组。在又一个具体方面中，所述抗体具有降低的或最小的效应子功能。在又一个具体方面中，所述最小的效应子功能由去糖基化(glycosylation)产生。

28、在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为嵌合抗体或嵌合抗体片段。

29、在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人抗体或人抗体片段。

30、在另一实施方案中，本发明抗体或抗体片段为人源化抗体或人源化抗体片段。

31、在另一实施方案中，本发明抗体片段为fab、fab’、fab’-sh、fv、scfv或f(ab’)2抗体片段。

32、在另一实施方案中，本发明抗体片段为双抗体。

33、本发明还包括包含上述结合人pd-1的抗体或抗体片段中的任一种的双特异性抗体。

34、在另一实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：

35、(a)重链，其序列与seq id no：34、seq id no：36或seq id no：38所示的氨基酸序列一致；以及

36、(b)轻链，其序列与seq id no：40、seq id no：42或seq id no：44所示的氨基酸序列一致；

37、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

38、在本发明特别优选的实施方案中，本发明提供了分离的单克隆抗体，其包含：

39、(a)重链，其序列与seq id no：34所示的氨基酸序列一致；以及

40、(b)轻链，其序列与seq id no：40所示的氨基酸序列一致；

41、其中所述抗体或其抗原结合部分与pd-1特异性结合。

42、本发明提供了编码所述抗体或抗体片段的分离的多核苷酸。在一些实施方案中，编码抗体重链的核苷酸序列如seq id no:20、seq id no:24、seq id no:28、seq id no:30、seq id no:33、seq id no:35、或seq id no:37所示，编码抗体轻链的核苷酸序列如seqid no:21、seq id no:25、seq id no:29、seq id no:39、seq id no:41或seq id no:43所示。

43、本发明提供了包含所述分离的多核苷酸的表达载体，以及包含所述表达载体的宿主细胞。

44、本发明提供了药物组合物，包含所述抗体或抗体片段以及可药用载体。

45、本发明提供了提高免疫细胞活性的方法，包括使免疫细胞与所述抗体或抗体片段接触。

46、本发明提供了治疗疾病的方法，所述方法包括将治疗有效量的本发明的抗体或抗体片段给予需要治疗的受试者。在又一方面，本发明提供了调控受试者中免疫应答的方法，其包括给受试者施用本发明的抗体或其抗原结合部分，使得受试者中的免疫应答得到调控。优选的是，本发明的抗体增强、刺激或增加受试者中的免疫应答。

47、在一些实施方案中，其中所述疾病为癌症或感染性疾病。在一些实施方案中，所述方法包括对受试者联合应用其他药物或疗法。

48、本发明提供了所述抗体或抗体片段在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述疾病为癌症或感染性疾病。在一方面，本发明提供了抑制受试者中肿瘤细胞生长的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗pd-1抗体也能够替代(或与本发明的抗pd-1抗体联合)使用。例如，在抑制肿瘤生长的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗pd-1抗体。

49、在另一方面，本发明提供了治疗受试者中传染病的方法，其包括给受试者施用治疗有效量的抗pd-1抗体或其抗原结合部分。在该方法中优选使用本发明的抗体，虽然其它抗pd-1抗体也能够替代(或与本发明的抗pd-1抗体联合)使用。例如，在治疗传染病的方法中可以使用嵌合的、人源化的或完全人的抗pd-1抗体。

50、在一些实施方案中，利用本发明所述的抗体在抑制肿瘤细胞生长时其亲和力更高，阻断效果更好，细胞杀伤活力更高。其亲和力比现有治疗性单抗的亲和力高出大约10倍，体外阻断pd-l1/pd-1的相互作用非常有效。与美国公司(bms)的已上市产品opdivo(nivolumab)相比，其阻断效果和体外杀伤活性均有所提高，在抑制肿瘤细胞生长方面本发明的单抗效果更加优异。