一种检测微生物污染程度的试剂盒的制作方法

本技术涉及一种检测微生物污染程度的试剂盒，属于生物化学检测领域。

背景技术：

1、传统的微生物污染程度的检测方法主要为微生物培养法和ph方法，其中微生物方法操作复杂，劳动强度大，对操作人员的技术水平要求高，检测速度慢、通常需要7-19天，需要无菌操作环境；ph方法主要通过检测样品中ph的变化来判断微生物污染程度，通常需要5-14天，需要无菌操作环境，另外并非所有微生物的生长繁殖都会改变ph，因此ph方法易出现假阴性结果。由于这些检测方法检测速度较慢，可适用于保质期较长的罐头类食品的检测，而乳制品等自动化程度较高且保质期较短的食品则不适用这样的检测方法。

2、atp是一种能量分子，普遍存在于有机体中，atp含量与微生物活细胞数量成一定正比关系。因此，通过检测样品中atp的含量判断微生物的污染程度是一种非常有市场前景的、快速检测样品中微生物污染的方法。这种方法的步骤大体包括：首先通过atp降解剂去除微生物细胞外的游离atp(若是植物源性食品，要先提取植物体细胞atp)；再酶解游离atp和/或植物体细胞atp；然后裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的atp；再后在荧光素酶的存在下，atp可与荧光素快速反应并发光；最后通过检测仪捕获atp发光反应的发光信号并报告结果。这种方法存在的问题是：atp降解酶在反应中活力不足，游离atp去除不完全，微生物细胞裂解不充分，缺乏优质的反应体系，同一套检测方法对不同的样品难以均获得准确度、精密度、灵敏度俱佳的检测结果等。

3、尽管atp生物发光法检测微生物污染程度的原理是人们已知的，但根据该原理的改良和创新仍然非常有价值，这是因为一套完整高效的方法是由若干不同的步骤有机的、策略地组合在一起而实现的，而不是单独割裂地改进某个步骤。比如裂解细胞的方法有很多，加热裂解、机械裂解、化学裂解等，其中，采用表面活性性剂是化学裂解中的一种方式。表面活性剂按类别分为离子型表面活性剂(包括阳离子表面活性剂与阴离子表面活性剂)、非离子型表面活性剂、两性表面活性剂、复配表面活性剂、其他表面活性剂等，且人们可以不断地合成各种新的表面活性剂，因此，属于表面活性剂的化合物可能不计其数。然而，并不是所有的表面活性剂一概适于在任何条件下裂解细胞，在atp生物发光法检测微生物污染程度的方法中，适用的表面活性剂需要考虑具备以下特点：(1)可快速杀死活细胞并破碎细胞膜以获得最大atp的量；(2)使atp水解酶失活并且还不能影响atp的性质；(3)不影响或轻微影响后续检测步骤中的荧光素酶的活性。所有这些特点既可以通过实验直接检测，也可通过最终对atp的检测效果来间接验证。可见，能否筛选出适于该方法的优良表面活性剂化合物是无法预料的，因而并不能被认为是常规的。

4、对于植物源性样品中的微生物污染进行检测时，还需要进一步保证采用某个表面活性剂裂解植物细胞并提取植物细胞atp时，该表面活性剂不会同时裂解微生物细胞，造成微生物细胞atp被过早释放影响检测结果的准确性。因此，该表面活性剂的选择就需要更加慎重，而不能任意采用其他表面活性剂替代。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，发明人联合多家科研单位共同研发，将整套atp检测方法流程中的每个环节拆分开来，逐一进行改良，分工协作，再组合起来实验并调整，最终摸索出了一套高效的微生物污染程度检测方法，构建了完整的检测系统，包括试剂盒、检测方法及设备。

2、就检测方法而言，按检测对象不同分为两类：一类是非植物源性的样品，另一类是植物源性样品。

3、对于非植物源性的样品而言，检测方法包括如下步骤：样品制备；加入atp降解剂降解样品中的游离atp；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的atp；在荧光素酶的存在下，使atp可与荧光素快速反应并发光；检测发光信号并反馈结果。

4、在该方法中，主要的改进点为①使用三甲基甘氨酸作为微生物细胞裂解剂中的主要成分，且形成了包括十八烷基三甲基氯化铵、三甲基甘氨酸和edta的改良的微生物细胞裂解剂。②改良了atp降解剂中的atp降解缓冲液，加入了zn2+离子，最终形成了包括znso4、琥珀酸和氢氧化钠的改良的atp降解缓冲液。

5、对于植物源性的样品而言，检测方法包括如下步骤：样品制备；用植物细胞提取剂提取植物细胞atp；加入atp降解剂降解样品中游离atp和植物体细胞atp；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的atp；在荧光素酶的存在下，使atp可与荧光素快速反应并发光；检测发光信号并反馈结果。

6、在该方法中，主要的改进点除了包括上述①和②之外，还进一步包括③采用脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚作为植物细胞提取剂的主要成分。

7、为了完整优化全套检测系统，对于上述两类方法，本技术进一步的改进点还包括④确定了脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的最佳浓度、微生物细胞裂解剂的最佳反应时间、atp降解缓冲液中zn2+离子的最佳浓度、mg2+、海藻糖、二硫苏糖醇和bsa的最佳含量，样品最佳孵育时间等，使该系统真正成为一套可规模化操作的系统。具体而言：

8、本技术首先提供一种植物体细胞atp提取剂，包括脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚。

9、在一种实施方式中，脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的浓度为0.2％。

10、在一种实施方式中，脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚的氧乙烯基的数量为3-9。

11、本技术进一步提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的atp提取剂。

12、在一种实施方式中，试剂盒还包括atp降解酶、atp降解缓冲液和/或微生物细胞裂解剂。

13、在一种实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。

14、本技术还提供上述atp提取剂或试剂盒在提取植物细胞atp中的用途。

15、本技术还提供上述atp提取剂或试剂盒在检测微生物污染中的应用。

16、本技术还提供了一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，其特征在于，使用上述的atp提取剂或试剂盒进行鉴定。本技术首先提供一种微生物细胞裂解剂，包括三甲基甘氨酸。

17、在一些实施方式中，裂解剂进一步包括十八烷基三甲基氯化铵和edta。

18、在一些实施方式中，裂解剂的制备方法为：称量495-505mg十八烷基三甲基氯化铵、3.5-4.5g三甲基甘氨酸、0.142-0.150mg edta，加入800ml无atp水中，溶解后定容至1l。

19、本技术还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括上述的微生物细胞裂解剂。

20、在一些实施方式中，试剂盒还包括atp降解酶、atp降解缓冲液和/或植物细胞atp提取剂。

21、在一些实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。

22、上述的裂解剂、或上述的试剂盒在裂解微生物细胞中的用途。

23、上述的裂解剂、或上述的试剂盒在检测微生物污染中的应用。

24、本技术还提供一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，使用上述的裂解剂或上述的试剂盒。

25、本技术还提供一种检测样品中atp含量的方法，其特征在于，使用上述的裂解剂或上述的试剂盒。

26、本技术首先提供一种atp降解缓冲液，包括zn2+离子。

27、在一种实施方式中，atp降解缓冲液包括znso4、琥珀酸和氢氧化钠。

28、本技术还提供一种atp降解剂，包括上述的缓冲液以及atp降解酶。

29、在一种实施方式中，atp降解酶包括三磷酸腺苷双磷酸酶和/或腺苷磷酸脱氨酶。

30、本技术还提供一种试剂盒，包括上述的atp降解缓冲液。

31、在一种实施方式中，试剂盒进一步包括atp降解酶、植物细胞atp提取剂和/或微生物细胞裂解剂。

32、在一种实施方式中，试剂盒还包括发光反应试剂和/或发光反应缓冲液。

33、上述的atp降解缓冲液、或上述的atp降解剂、或上述的试剂盒在降解atp中的用途。

34、上述的atp降解缓冲液、或上述的atp降解剂、或上述的试剂盒在检测微生物污染中的应用。

35、本技术还提供一种鉴定样品中微生物污染程度的方法，其特征在于，使用上述的atp降解缓冲液、或上述的atp降解剂、或上述的试剂盒。

36、本技术提供一种检测仪，包括流体系统、光电系统、微孔板承载系统和软件系统；所述流体系统由分液系统和注射系统组成；所述光电系统由高灵敏的光电倍增管和信号收集器组成。

37、在一些实施方式中，流体系统中采用反向泵将使用后残留在管线中的试剂泵回试剂瓶中。

38、在一些实施方式中，光电倍增管采用百叶窗设计。

39、本技术还提供一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括atp降解酶、atp降解缓冲液和/或微生物细胞裂解剂；可选的，所述试剂盒还包括植物细胞atp提取剂；可选的，所述试剂盒还包括发光反应试剂和发光反应缓冲液；其中：所述atp降解缓冲液中包括zn2+离子；或者所述微生物细胞裂解剂包括三甲基甘氨酸；或者所述植物细胞atp提取剂包括脂肪醇聚氧乙烯聚二甘油醚。

40、本技术还提供一种用于检测样品微生物污染程度的系统，其特征在于，包括上述的检测仪和/或上述的试剂盒。

41、本技术还提供一种检测atp含量的方法或鉴定微生物污染程度的方法，其特征在于，包括使用上述的检测仪，或使用上述的试剂盒，和/或使用上述的系统。

42、在一些实施方式中，所述方法包括：样品制备；通过atp降解剂降解游离atp和/或植物体细胞atp；用微生物细胞裂解剂裂解微生物活细胞以释放出微生物活细胞内的atp；使atp与荧光素反应并发光；通过检测仪捕获发光信号并反馈结果。

43、在一些实施方式中，atp与荧光素反应的发光反应缓冲液中包括mg2+、海藻糖、bsa和二硫苏糖醇。

44、在一些实施方式中，样品制备包括使样品在适于微生物生长的温度下(例如36℃)中保温(如24-72小时，优选为48小时)的步骤。

45、在一些实施方式中，所述方法进一步包括通过检测发光强度判断微生物的污染程度，当rlu值小于150时，结果为阴性；当rlu值为151-300时，结果为疑似阳性；当rlu值大于300，结果为阳性，表明存在微生物污染。