一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法

本发明属于分子生物学，具体涉及一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法。

背景技术：

1、四纹豆象callosobruchus maculatus(fabricius)和菜豆象acanthoscelidesobtectus(say)均属鞘翅目(coleoptera)豆象科(bruchuidae)，为我国重要的检疫性有害生物，两者主要危害豆科植物种子，发生极为隐蔽，难以直接察觉。此外，它们的各个虫态均可随豆类农产品携带，且成虫的飞翔能力强，可藏匿于货物和交通工具缝隙处而远距离传播，故在进出口贸易过程中以及货物储藏期间对其进行有效检疫检测显得尤为重要。然而现有的针对这两种豆象的检疫检测技术有明显局限性，如过筛法只能分离到已钻出豆粒的成虫，无法分离到藏匿于豆粒内部的幼虫、蛹及已羽化但尚未钻出豆粒的成虫；整粒粮悬浮法只能悬浮起内部已被明显侵害的豆粒，无法悬浮起里面的幼虫还处于低龄、受害尚轻的那些豆粒，加上绝大多数情况下待检测样品中的目标豆象个体数极少，采用现有检疫检测技术存在较大的漏检可能性。

2、有报道称四纹豆象和菜豆象上的寄生螨属于蜱螨总目(acariformes)真螨目(acarivander)蒲螨总科(pyemoridea)蒲螨科(pemotidae)蒲螨属(pyemotes)中的球腹蒲螨组(pyemotes ventricosus group)，该类群的蒲螨具有特殊的生活史和形态特征，寄生时附着在寄主体表吸食体液并腹部膨大形成膨腹体，膨腹体在外力作用下极易脱落，同时所摄取的寄主组织遗传信息能在其体内留存一定时间。据此特点，本发明首次提出一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，在已有的过筛法检测基础上，利用筛落的豆象寄生螨辅之以分子检测手段来间接检测样品中存在的豆象种类，以提高检测到豆象的可能性，减少漏检。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供了一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，可有效判断样品中所藏匿豆象的种类。

2、为实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

3、一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，其操作如下：

4、(1)利用过筛法从待检测的样品中分离得到寄生螨膨腹体。

5、(2)利用dna试剂盒提取寄生螨膨腹体的基因组总dna。

6、(3)以上述基因组总dna为模板，利用四纹豆象和菜豆象的线粒体细胞色素氧化酶b基因(cytb基因)序列的特异性引物分别进行pcr扩增，其中序列c的正反引物分别为：5’-ctcatgggcagttacaatcacag-3’(seq id no.1)、5’-atagacytctgggtggccra-3’(seq idno.2)；序列a的正反引物分别为：5’-gccacctttcatggaactcaa-3’(seq id no.3)、5’-tgcaaatacagctcctatagaaagaaca-3’(seq id no.4)，pcr反应体系为50μl，其中2×gotaqmaster mixes 25.0μl，正向、反向引物各1.0μl(10nmol/l)，dna模板量(≥50ng)5.0μl，ddh2o补足体系至50μl；反应条件如下：循环前94℃预变性5min，每个循环包括94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸1min，共设40个循环，循环结束后于72℃再延伸10min，pcr产物于4℃保存。

7、(4)以2％浓度的琼脂糖凝胶电泳pcr产物，经溴乙锭染色后于紫外灯下观察，通过与阳性条带对比，判断样品中是否存在豆象虫体并鉴定其种类。

8、与现有的技术相比，本发明具有的优点是：本发明提供了一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，利用寄生于两种豆象上的寄生螨发育而成的膨腹体中留存的寄主遗传信息进行间接检测。本发明方法在螨膨腹体离开寄主10天内皆有效果，且所需膨腹体数量较少，具有灵敏较高(dna浓度达到1ng/μl即可测出)、适用性广且结果准确的特点。尤其在检疫场景中，本发明方法作为豆象的物理过筛检测技术的补充，当筛落物中未见明显豆象残体组织或虫体碎片较少却能获得膨腹体的情况下，该法将有助于判断样品中隐匿豆象的可能性以及其具体种类，减少漏检可能。

技术特征：

1.一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，操作如下：

2.根据权利要求1所述的一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，其特征在于，步骤(1)中，所述分离得到的寄生螨膨腹体是寄生螨在取食四纹豆象以及菜豆象虫体后所形成的腹部膨大的螨体。

3.根据权利要求1所述的一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的四纹豆象和菜豆象线粒体细胞色素氧化酶b基因(cytb基因)序列的特异性引物分别为：

4.根据权利要求1所述的一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法，其特征在于，步骤(3)中的pcr扩增反应体系为50μl，其中2×gotaq master mixes 25.0μl，正向、反向引物各1.0μl，dna模板量5.0μl，ddh2o补足体系至50μl；扩增条件如下：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火50s，72℃延伸1min，40个循环，72℃再延伸10min。

技术总结
本发明公开了一种用寄生螨间接检测四纹豆象和菜豆象的分子方法。通过采用基于这两种豆象线粒体细胞色素氧化酶b基因(Cyt b基因)的特异性引物，可从豆象体表寄生的螨中扩增出目标豆象特定大小的DNA片段。采用此引物，以供测豆粒过筛得到的螨膨腹体DNA为模板进行PCR扩增，对扩增产物作琼脂糖凝胶电泳检测后，即可判断供测豆粒中是否存在目标豆象及其种类。本发明方法在螨膨腹体离开寄主体表10天内均可成功检测出寄主的种类信息，具有实用性强、准确度高、操作容易等优点。尤其在检疫场景中，当筛落物中未见或仅有少量豆象残体组织但可见到螨膨腹体的情况下，本方法可作为豆象过筛检测技术的补充，有效检出并鉴定样品中隐匿豆象的具体种类。

技术研发人员：蒋明星,商颖婕,倪美虹
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16