大叶相思AaRD22蛋白及其编码基因在改善植物抗旱耐盐中的应用的制作方法

本发明属于植物基因工程领域，具体涉及大叶相思脱水应答蛋白(acaciaauriculiformis responsive to dehydration,aard22)及其编码基因aard22在改善植物抗旱性和耐盐性方面的应用。

背景技术：

1、全球气候持续恶化不仅威胁人类的生存环境，还带来各类频繁的自然灾害如干旱、洪涝、高温、冻害、病虫害爆发等。植物由于固着生长的特质，不能够和动物一样及时规避突发的不利因素，使得植物在生长发育过程中反复受到各类逆境胁迫的干扰。极端干旱、高盐等非生物胁迫是遏制植物正常生长发育的重要环境因素，目前全世界范围内主要栽种农作物每年将近50％的产量减损都和存在的非生物胁迫密切相关(valliyodan b,nguyenht.understanding regulatory networks and engineering for enhanced droughttolerance in plants.curr opin plant biol.2006,9(2):189-195)。为了应对恶劣的环境变化，植物进化出一系列防御措施来减缓各类非生物胁迫造成的伤害。非生物胁迫因素常常造成植物体内生理生化代谢的紊乱，导致胁迫响应蛋白及其编码基因的差异表达。因此，发掘植物非生物胁迫响应蛋白及其编码基因资源，对逆境胁迫作物进行遗传改良，进而创制/培育高抗逆新品种，具有重要的科学价值。

2、大叶相思(acacia auriculiformis)是豆科金合欢属(acacia)常绿乔木，是热带和亚热带地区广泛栽培的速生树种，集用材、观赏、水土保持、涵养水源、药用价值于一身。由于其生长快，适应性强，耐干旱瘠薄，在土壤被冲刷严重的酸性粗骨质土、砂质土和粘重土里均能生长(wong mm,cannon ch,wickneswari r.identification of lignin genesand regulatory sequences involved in secondary cell wall formation inacaciaauriculiformis and acacia mangium via de novo transcriptome sequencing.bmcgenomics.2011,12:342)，在我国华南地区速生丰产，是困难立地造林的先锋树种，在低缓的平原、丘陵水土流失区和滨海风积沙地区仍然随处可见大叶相思高大挺拔的身姿，已成为造林绿化、水土保持和改良土壤的主要树种之一。

3、脱水应答蛋白22(responsive to dehydration,rd22)，是植物特异的一类rubp蛋白家族(含usp、rd22、pg1β和bnm2四大亚家族)之一，与植物响应土壤干旱、盐渍化等紧密相关，是植物重要的候选耐逆基因。拟南芥(arabidopsis thaliana)脱水应答蛋白atrd22是一个多因素诱导型蛋白，受低温、盐胁迫、干旱、金属cu2+等外源处理的诱导上调表达，在干旱和盐渍胁迫下，atrd22介导aba响应元件(ryacgtggyr)受aba信号通路激活调控，并与转录因子atmyc2/rd22bp1和atmyb2蛋白互作，提高atrd22突变体的耐旱能力(abe h,urao t,ito t,seki m,shinozaki k,yamaguchi-shinozaki k.arabidopsisatmyc2(bhlh)andatmyb2(myb)function as transcriptional activators in abscisic acidsignaling.plant cell.2003,15(1):63-78)。研究发现，脱水应答蛋白的表达与植物抗旱及耐盐密切相关，然而具体的生物学功能和作用机制尚不清楚。此外，脱水应答蛋白种类较多，它们在植物应对各类逆境胁迫时发挥的不同功能，因此大叶相思的aard22蛋白及其编码基因的作用还有待研究。

技术实现思路

1、本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一个大叶相思脱水应答蛋白aard22与其编码基因aard22，及其在提高植物抗旱和耐盐中的应用。

2、本发明的第一个目的是提供脱水应答蛋白aard22，其核苷酸序列如seq id no.1所示，所编码的氨基酸序列如seq id no.2所示。

3、本发明的大叶相思脱水应答蛋白aard22的核苷酸长度为1116bp，编码371个氨基酸，蛋白质分子量为42.07kda，包含30个酸性氨基酸，35个碱性氨基酸，其中亮氨酸(leu)所占比例最大，达到9.2％，其次是占比为8.9％的缬氨酸(val)，rubp-rd22蛋白的等电点为8.68，化学式为c1909h2976n498o535s19，脂溶指数为93.99，总平均亲水性为-0.018，介于-0.5至0.5之间，为亲水性蛋白。plant-mploc在线网站预测发现，rubp-rd22蛋白定位于细胞壁。rubp-rd22蛋白具有两个保守的结构域：位于7-51位置(e-value为1.1×e-3)的agrb结构域(pf04647)；位于158-367位置(e-value为4.1×e-76)的rubp结构域(pf03181)。

4、本发明还提供含有所述的大叶相思脱水应答蛋白aard22的重组载体。

5、优选，所述的重组载体为pcambia1301-aard22。

6、本发明还提供含有所述的重组载体的工程菌。

7、优选，所述的工程菌为含有pcambia1301-aard22的农杆菌gv3101(psoup-p19)。

8、本发明还提供所述的aard22在提高植物抗旱和耐盐中的应用。

9、优选，所述的应用，为所述的大叶相思脱水应答蛋白aard22在提高大叶相思抗旱和耐盐中的应用。

10、本发明的有益效果是：本发明从大叶相思中成功发掘并克隆到一个脱水应答蛋白，命名为aard22，通过遗传转化技术，揭示了aard22具有抗旱和耐盐的响应元件(例如，脱水响应元件dre、aba诱导响应元件abre、干旱胁迫诱导元件mbs、及逆境胁迫诱导元件stre)，并在大叶相思中改善转基因植物抗旱和耐盐的应用，有助于深入了解大叶相思脱水应答蛋白aard22在植物抗旱和耐盐方面的生物学功能，也可以为木本植物开展抗旱和耐盐的研究提供基因资源，将在植物基因工程改良植物抗旱和耐盐的研究中发挥作用。

技术特征：

1.大叶相思脱水应答蛋白aard22，其特征在于，氨基酸序列如seq id no.2所示。

2.编码权利要求1所述的大叶相思脱水应答蛋白aard22的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，核苷酸序列如seq id no.1所示。

4.含有权利要求2或3所述的脱水应答蛋白aard22的基因的重组载体。

5.根据权利要求4所述的重组载体，其特征在于，所述的重组载体为pcambia1301-aard22。

6.含有权利要求2或3所述的重组载体的工程菌。

7.根据权利要求6所述的工程菌，其特征在于，所述的工程菌为含有pcambia1301-aard22的农杆菌gv3101(psoup-p19)。

8.权利要求1所述的大叶相思脱水应答蛋白aard22在提高植物抗旱和耐盐中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，是在植物中超量表达脱水应答蛋白aard22的编码基因在提高植物抗旱和耐盐中的应用。

技术总结
本发明提供了大叶相思脱水应答蛋白AaRD22及其编码基因在提高植物抗旱和耐盐中的应用。本发明所提供的脱水应答蛋白AaRD22是从大叶相思中获得，所述大叶相思AaRD22具有SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列，其编码蛋白质具有SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。通过遗传转化技术异源过量表达AaRD22基因，显著提升大叶相思的抗旱耐盐能力。因此，大叶相思AaRD22基因及其编码蛋白为大叶相思抗旱耐盐的新基因资源，将在大叶相思抗旱耐盐品种遗传改良中发挥重要作用，具有良好的应用前景。

技术研发人员：张桂华,李贺鹏,岳春雷,房瑶瑶
受保护的技术使用者：浙江省林业科学研究院
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15