一种组织解离方法与流程

本发明属于原代细胞分离，尤其涉及一种组织解离和解离后的组织颗粒转移，甚至培养过程都处于密封环境中的组织解离方法。

背景技术：

1、原代细胞是从体内组织或器官中直接分离和培养的细胞，原代细胞在临床医学和治中也有着广泛的应用。例如，从肿瘤组织中分离肿瘤浸润性淋巴细胞(tils)，tils是指存在于肿瘤组织、肿瘤转移淋巴结等组织中的淋巴细胞。tils细胞中含有较高比例的肿瘤特异性淋巴细胞，这一类淋巴细胞通过体外分离、扩增、活化后已作为一种临床治疗手段可用于肿瘤的过继性细胞免疫治疗，并在恶性黑色素瘤等癌种的治疗中取得了较好的临床效果。

2、传统的组织解离方法是将临床(例如，无菌环境的手术室)获得的标本转移至实验室，在超净工作台内使用无菌剪刀将组织块剪开，再用剪刀或刀片剁成小碎片，使细胞得以自由分散，再进行后续的培养扩增。该方法始终无法避免将组织块暴露的风险，存在易污染、效率低的问题。使得该类细胞治疗产品的生产对环境洁净度要求高，成本增加。

3、为了避免污染，通常需要将从一个无菌环境(例如手术室)中获取到的组织样品利用密闭容器进行存储，并转移至实验室或检验室，然后在另一个无菌操作环境下(例如大型无菌操作设备下)将该组织样品加入到组织解离装置中进行解离，并且解离之后，在该无菌操作环境下转移至培养皿中。然而，这种方式需要单独无菌操作环境，无疑会大大增加成本，并且不仅使得整个操作过程都比较繁琐，也对操作人员的要求较高；并且，对于一些偏远地区，或一些条件较差的实验室或检测机构或医疗机构来说，因为无法购入大型的无菌操作设备或提供一个无菌操作环境而导致无法进行组织解离，从而无法进行组织培养。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供一种组织解离方法，通过全封闭式处理避免了组织在解离和转移过程中被污染的风险。

2、为了解决上述所提到的技术问题，本发明具体采用以下技术方案：一种组织解离方法，基于一种组织解离器，所述组织解离器包括：滑套，以及可与所述滑套一端可拆卸地连接的底座；所述底座内设置解离腔，还包括可沿滑套轴向内空运动至所述解离腔的解离活塞杆，所述滑套内靠近所述解离腔的一端设置有活塞活动腔，当所述底座与所述滑套连接时，所述解离腔与所述活塞活动腔拼合形成用于向所述解离活塞杆的解离活塞提供轴向运动路径的解离操作腔；所述解离活塞上设置有用于解离组织的解离部，而所述解离活塞杆的另一端套有复位弹簧，所述复位弹簧一端抵接在解离活塞杆上，另一端抵接于滑套内的弹簧座；所述活塞活动腔上设置有一端与解离操作腔连通进液管和出液管，所述进液管和出液管未与所述解离操作腔连通的一端封闭；相应地，所述组织解离方法具体包括步骤：

3、将预先放置在无菌采集环境中的底座与滑套分离，并将获得的待解离组织置入底座的解离腔内，然后将所述底座与滑套连接，使得所述解离腔与所述活塞活动腔形成所述解离操作腔；

4、利用接管机将培养液袋的出液软管和无菌培养袋的进液软管分别与所述进液管和所述出液管连通，使得所述培养液袋和所述无菌培养袋与所述解离操作腔连通；

5、将所述培养液袋中的第二预设体积量的培养液挤压进入所述解离腔，然后阻断所述培养液袋与所述解离操作腔之间的进液通路；

6、驱动所述解离活塞杆对所述待解离组织进行解离；其中，解离过程中，所述无菌培养袋与所述解离操作腔之间的出液通路保持通畅；其中，所述解离活塞杆与所述解离腔底部的初始距离小于解离过程中所述解离活塞杆与所述解离腔底部之间的最大距离；

7、解离完成后挤压培养液袋，使得培养液袋中剩余的培养液对解离操作腔进行冲洗并将解离后的组织冲入无菌培养袋中；

8、阻断所述无菌培养袋与所述解离操作腔之间的出液通路，并将所述无菌培养袋与所述组织解离器分离，且分离后的所述无菌培养袋处于封闭状态。

9、本发明的一些实施例中，驱动所述解离活塞杆之前，利用管夹隔断所述培养液袋与所述解离操作腔之间的进液通路。

10、本发明的一些实施例中，为了保证解离活塞杆能够充分活动，还在所述培养袋中预存有第一预设体积量的无菌气体(即灭菌后的气体)，且解离过程中，所述无菌培养袋中气体的体积量与所述解离活塞杆距离所述解离腔底部的距离呈负相关。优选地，该第一预设体积量小于该无菌培养袋的容量。

11、本发明的一些实施例中，所述培养液袋包括第一腔室和第二腔室，以及与所述第一腔室连通的出液软管，所述第一腔室和所述第二腔室之间设置有分隔膜，所述分隔膜可在外作用力的作用下开启，使得所述第一腔室和所述第二腔室连通，其中，所述第一腔室内预存培养液的第二预设体积量小于所述第二腔室内预存培养液的第三预设体积量；相应地，将所述培养液袋中的第二预设体积量的培养液挤压进入所述解离腔的步骤，具体包括步骤：

12、沿所述出液软管的方向挤压所述第一腔室，使得所述第一腔室内存储的第二预设体积量的培养液通过所述出液软管进入所述解离腔。

13、本发明的一些实施例中，挤压培养液袋，使得培养液袋中剩余的培养液对解离操作腔进行冲洗并将解离后的组织冲入无菌培养袋中的步骤，具体包括步骤：

14、挤压所述第二腔室，使得所述第一腔室与所述第二腔室之间的分隔膜开启，从而使得所述第二腔室内的培养液进入所述第一腔室；

15、沿所述出液软管的方向多次挤压所述第一腔室，使得所述第二预设体积量的培养液通过所述出液软管进入所述解离操作腔对解离操作腔进行冲洗并将解离后的组织冲入无菌培养袋中。

16、本发明的一些实施例中，所述进液管和出液管倾斜设置使得其延长线经过解离腔底部。

17、本发明的一些实施例中，所述出液管和所述进液管的中心线的延长线与所述解离操作腔的中心线相较于一公共点，且所述公共点位于所述解离腔内。

18、在本发明的一些实施例中，沿所述出液软管的方向多次挤压所述第一腔室的步骤具体包括：

19、挤压所述第一腔室，使得所述培养液进入所述解离操作腔；

20、振荡或摇晃所述组织解离器，使得粘附在所述解离操作腔腔壁上的大部分组织颗粒脱离所述腔壁，并汇聚于所述解离腔底部；

21、将所述组织解离器倾斜放置，并多次挤压所述第一腔室，使得所述培养液在挤压作用和重力作用下冲洗所述解离腔底部，以将解离后的组织颗粒冲入无菌培养袋中。

22、本发明的一些实施例中，当将所述组织解离器倾斜放置时，所述解离操作腔的中心线与水平线之间的夹角为0°-45°。

23、本发明的一些实施例中，所述进液管和出液管均为塑料软管。

24、本发明的一些实施例中，所述解离部安装在解离活塞端部；所述解离活塞的直径大于解离活塞杆，所述解离腔上端设置有限位台阶。

25、本发明的一些实施例中，所述解离活塞杆上设置有环形密封圈；且所述底座与所述滑套之间设置有环形密封圈。

26、本发明的有益之处在于：本发明中的底座部分作为耗材一次性使用，使用时在无菌环境(例如手术室)中承接临床获得的标本(待解离组织)并立即与套管连接，使得待解离组织处于密封空间；然后通过接管机将培养液袋和无菌培养袋分别与原本封闭的进液管和出液管进行无菌连通后再解离；且当组织解离完成后，通过培养液袋中的培养液对解离腔进行冲洗从而将解离后组织冲入无菌培养袋中完成组织的转移，且转移之后，还可利用热合机等方式阻断无菌培养袋与解离操作腔之间的出液通路，并将无菌培养袋从组织解离器上分离，使得无菌培养袋可直接进行无菌培养；整个解离和转移组织的过程，甚至培养的过程均在密闭环境中进行，无需单独提供无菌环境，也无需再单独设置密闭容器来进行培养，使得组织的解离更加的方便减少环境的约束，同时使得解离后的组织免除了被污染的风险。

27、本发明中通过预先在培养袋中预存了一定的无菌气体，从而为解离活塞在解离操作空间内能够自由滑动提供了可能，避免了在密封环境下，因误操作等原因导致解离操作空间内气压不足而使得解离活塞杆不能够移动至最大行程，甚至无法滑动的情况。

28、更进一步地，本发明中分别根据不同的操作过程，例如解离过程和转移过程所需的培养液量，分别在培养液袋的两个腔室内进行定量存储，从而避免了解离过程中因为人工操作不稳定而导致培养液被压入解离操作腔内过多而削弱解离活塞作用于组织的作用力，从而导致解离操作时间更长，甚至溢出培养液；或过少而使得解离活塞直接作用于组织的作用力过大而损坏组织。

29、如前所述，组织解离过程和转移过程，甚至培养过程都是在无菌密闭环境下完成，并且无需单独提供一个无菌操作环境或无菌操作设备，从而大大降低了对操作人员的要求，也降低了成本，并且使得即使偏远地区或经济条件差的实验室、医疗机构和检测机构都能够进行组织解离和培养，相较于现有组织解离装置，其灵活性更高，适应范围更广。

30、本发明通过在解离活塞杆的顶部设置了复位弹簧，并在滑套内沿径向设置了一个为活塞提供较大活动空间的活塞活动空间，从而当其与底座组装后，与解离腔形成了一个较大的解离操作空间，并且在弹簧的作用下，使得初始状态(即压盘未受到外作用力)下，解离活塞的端部与解离腔底部之间的初始距离小于该解离活塞所能够移动的最大行程，且大于最小行程，能够避免当底座安装上之后，应处于最小行程位置而使得活塞上的刀片直接与待解离组织接触；同时，由于弹簧安装腔的设置，使得解离活塞杆与滑套之间的直接接触的部分缩短，避免解离过程中推送解离活塞杆时受到较大的阻力；当然在弹簧回复力作用下，也使得解离操作更加省力方便。