基于RPA-CRISPR/Cas12a检测十二指肠贾第虫集聚体A或者B的试剂盒及检测方法

本发明属于病原检测。更具体地，涉及基于crispr/cas12a分别快速精准检测十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b的两种试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、常见的十二指肠贾第虫检测技术有

2、显微镜检查法：需要专业的技术人员，耗时耗力，且敏感性较低。

3、免疫学检查法：这类方法是基于抗原-抗体的免疫反应，通过识别病原相关蛋白，判断是否存在检测病原。抗原抗体间存在交叉反应，会影响其检测的特异性。而且，免疫学现有技术的灵敏度也普遍低于核酸分子检测方法。

4、分子生物学检查:例如，巢式pcr是目前实验室最常用的十二指肠贾第虫检测方法，该技术的缺点是耗时长，需要依赖于pcr仪，对模板dna质量要求高；实时荧光定量pcr的缺点是耗时长，需要依赖于昂贵的实时荧光定量pcr仪和专业操作人员；lamp灵敏度高，且耗时短，但是极易污染，需在特定的实验室内进行操作，无法满足现场检验需求。

5、来源于multiplexed recombinase polymerase amplification assay todetect intestinal protozoa的开发了一种多重rpa与侧流试纸条结合的检测方法，来同时检测和区分引起宿主腹泻的十二指肠贾第虫、隐孢子虫和阿米巴原虫dna三种原虫，是目前找到最相似的一个多重rpa技术与侧流试纸条结合的方法，其缺点：1、该技术的敏感性为403copies/reaction,444个卵囊/reaction，相比于本发明建立的方法，敏感性低。2、不能检测出感染的十二指肠贾第虫集聚体类型，无法评估其人兽共患风险。

技术实现思路

1、巢式pcr-测序检测法，需要依赖于昂贵的pcr仪，且花费时间长；镜检法敏感性低，容易出现漏检误检，耗费人力的问题；免疫学检测方法容易出现交叉污染的问题；及多重rpa技术敏感性低、不能检测出感染的十二指肠贾第虫集聚体类型的问题；本发明旨在不需要依赖于昂贵的大型仪器和专业标准的实验室，能够应用于一线现场检测的简便、快速、精准的十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b的两种检测方法。

2、本发明研究发现，当十二指肠贾第虫集聚体a或集聚体b核酸与ca12a蛋白、以及特异的crrna结合，形成三元复合物后，ca12a蛋白的ruvc结构域将被激活，发挥非特异性单链dna切割功能，将带有荧光信号标记的单链dna（ssdna reporter）切割开。通过检测荧光或者观察试纸条上的检测线即可得知待检样品是否为十二指肠贾第虫集聚体a或集聚体b阳性。基于此，本发明分别构建了基于crispr/cas12a快速精准检测十二指肠贾第虫集聚体a或集聚体b的方法，分别设计了最特异、最高效、最灵敏的优质rpa引物和crrna，保证了十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b的检测效果。

3、因此，本研究提供了分别用于十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b检测的crrna，crrna序列见表1。所示crrna在检测十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b中的应用，以及在制备十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b检测产品中的应用，也均在本发明的保护范围之内。基于此，还分别提供了两种检测十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b的crispr/cas12a系统，包括上述crrna及其组合。具体地，所述crispr/cas12a系统还包括rpa扩增引物对rpa-f/rpa-r，序列见表2和表3。所述crispr/cas12a系统还包括单链荧光探针（hb reporter）和试纸条探针（fb reporter）, hb reporter序列为：hex-12n-bhq1，fbreporter序列为：fam-12n-biotin。所述crispr/cas12a系统还包括rpa扩增体系和crispr/cas12a检测系统所需试剂。

4、rpa扩增体系如下：下述表格的用量的确定值±10%都是允许范围

5、 试剂regents 用量volume（μl） buffer 29.5 无核酶水 8.2 上游引物（10nm） 2.4 下游引物（10nm） 2.4 <![cdata[mg²⁺]]> 2.5 dna模板 5 合计 50

6、所述crispr/cas12a检测体系如下：下述表格的用量的确定值±10%都是允许范围

7、 试剂regents 用量volume（μl） 无核酶水 12 buffer 2 fncas12a 1 rna酶抑制剂 1 hb reporter 1 crrna 1 rpa产物 2 合计 20

8、设计了集聚体a和集聚体b集聚体间特异且集聚体内保守的crrna，并可使用在线软件rnafold（http://rna.tbi.univie.ac.at//cgi-bin/rnawebsuite/rnafold.cgi）预测crrna二级结构。之后，合成了对应的ss crdna链，通过退火、转录、酶切和纯化步骤制备出crrna。集聚体a和集聚体b的crrna及ss crrna序列见表1。

9、表1 十二指肠贾第虫集聚体a和集聚体b的ssdna及crrna核苷酸序列

10、

11、表2 集聚体a rpa引物核苷酸序列

12、 引物名称primer name 核苷酸序列nucleotide sequence（5’ - 3’） f33 cttcaagtgtaacggctctcttgactttatc r254 ctactatcacatgcttcaaacccatgtcctg f34 ttcaagtgtaacggctctcttgactttatc r253 tactatcacatgcttcaaacccatgtcctga f35 tcaagtgtaacggctctcttgactttatca r267 ctttcagagtgccctactatcacatgcttca

13、表3 集聚体b rpa引物核苷酸序列

14、 引物名称primer name 核苷酸序列nucleotide sequence（5’ - 3’） f55 gacttcattaagagccacgtagcgtccatcg r289 gtctcgcccatgattctacgtctttcagag f125 ctccctcctttgtgcacctttctacagcta r287 ctcgcccatgattctacgtctttcagagtg f54 cgacttcattaagagccacgtagcgtccatc r284 gcccatgattctacgtctttcagagtgtcc

15、本发明在寻找十二指肠贾第虫集聚体a或者b的靶标基因位点时进行了大量摸索，为了使建立的检测方法具有良好的特异性和敏感性，最终以十二指肠贾第虫集聚体a或者b的 tpi位点（triosephosphate isomerase）为靶标位点；

16、基于rpa-crispr/cas12a检测十二指肠贾第虫集聚体a或者b的 tpi位点（triosephosphate isomerase）的靶点序列，所述靶点序列为十二指肠贾第虫集聚体a的 tpi基因位点 km190791的第 137 bp～第 160 bp位点的核苷酸序列；所述第 137 bp～第160 bp位点的核苷酸序列为seqid no:1；十二指肠贾第虫集聚体b的 tpi基因位点kp687783 的第 171 bp～第 194 bp位点的核苷酸序列；所述第 171 bp～第 194 bp位点的核苷酸序列为seqid no:2。

17、基于rpa-crispr/cas12a检测扩增十二指肠贾第虫集聚体a或者b的dna的上下游引物对，所述集聚体a第一组的上游引物f33的核苷酸序列为seq id no:3、对应下游引物r254为seq id no:4、第二组上游引物f34为seq id no:5 、对应下游引物r253为seq idno:6、第三组上游引物f35为seq id no:7、对应下游引物r267为seq id no:8； 所述集聚体b第一组的上游引物f55的核苷酸序列为seq id no:9、对应下游引物r289为seqid no:10、第二组上游引物f125为seq id no:11、对应下游引物r287为seqid no:12、第三组上游引物f54为seq id no:13、对应下游引物r284为seqid no:14。

18、基于rpa-crispr/cas12a检测增扩十二指肠贾第虫集聚体a或者b的dna的上下游引物对，所述集聚体a优选的上游引物为f35，其核苷酸序列为seq id no：7、对应下游引物r267为seq id no:8；所述集聚体b优选的上游引物为f125，其核苷酸序列为seq idno:11、对应下游引物r287为seq id no:12。

19、基于rpa-crispr/cas12a检测十二指肠贾第虫集聚体a或者b的dna的crrna，所述集聚体a的crrna 为crrna137-a，其核苷酸序列如seq id no：15所示；所述集聚体b的crrna为crrna171-b，其核苷酸序列如seqid no:16所示。

20、基于rpa-crispr/cas12a检测十二指肠贾第虫集聚体a或者b的试剂盒，包括权利要求2所述上下游引物对及rpa扩增体系的twistamptm basic kit试剂盒及试剂、权利要求4所述的crrna 及crispr/cas12a荧光检测反应体系的试剂及crispr/cas12a试纸条检测反应体系的试剂。

21、基于rpa-crispr/cas12a检测十二指肠贾第虫集聚体a或者b的方法，包括以下步骤：

22、（1）使用e.z.n.a. blood dna midi kit提取并得到dna模板；

23、（2）rpa扩增体系；

24、使用twistamptmbasic kit试剂盒进行rpa扩增，rpa的操作步骤为，先将buffer、无核酶水、上下游引物（a/b共六对之一）依次加入twistamptmbasic kit试剂盒配套的反应管中（管中有白色粉末），接着将5μl dna模板加到管壁上，最后再将mg2+加入到管盖上。试剂添加完毕后，盖上管盖，放入掌上离心机中离心3-5s，使mg2+和dna模板都离心至反应管中，之后再充分震荡混匀，使反应管内的粉末充分溶解并混匀。随后，将反应管再次放入掌上离心机中离心3-5s，离心后即可将反应管放入电热恒温培养箱中孵育，37℃（37-39℃）条件下反应6min（6-7 min）；反应6 min（6-7 min）后取出反应管，在振荡器上震荡15 s（10-15 s），再放入掌上离心机中离心3-5s，离心后再次放入电热恒温培养箱中，37℃（37-39℃）反应14min(13-14 min)即完成扩增；

25、（3）基于crispr/cas12a的荧光检测反应体系；

26、在配制好的rpa扩增体系中加入2 μl（2-2.5μl）的rpa产物，将其震荡混合均匀后，放入掌上离心机中离心3-5s；离心后将无酶反应管放入耶拿qtower 3g荧光定量pcr仪中测定其在hex通道的绝对荧光值，孵育温度为37℃（36-38℃），每隔30 s（25-35s）测定一次荧光值，共测定25min（20-30 min）；将反应结束后的反应管放置于蓝光仪下，当待检样品为阳性样品时，反应管内液体会有肉眼可见的荧光，而当待检样品为阴性样品时，则无肉眼可见的荧光；

27、（4）基于crispr/cas12a的试纸条检测反应体系；

28、将配置好的荧光检测反应体系放置于电热恒温培养箱中，37℃（36-38℃）孵育25min(20-30min)，吸出4 μl(3-5μl)的反应产物加入到196 μl（195-200μl）的稀释液中，震荡混匀后，吸出80 μl（75-85 μl）稀释后的反应液加入试纸条的加样孔，静待7-10 min后，观察试纸条即可。

29、本发明技术方案带来的有益效果

30、本发明有益效果：本研究首次研究并提供了基于crispr/cas12a快速并精准分别检测十二指肠贾第虫集聚体a或集聚体b的两种检测技术，该技术最大的优点是灵敏度高，本发明建立的检测十二指肠贾第虫集聚体a的检测方法最低能检测到2.04 cfu/ml和每克粪便中10个滋养体，基于crispr/cas12a建立的检测十二指肠贾第虫集聚体b的检测方法最低能检测到1.1cfu/ml和每克粪便中10个包囊。

31、本发明另一大优势是能够不通过测序直接检测到集聚体类型，目前实验室常用的检测方法为巢式pcr-测序法，该方法需要经过测序、序列拼接及blast后，才可知道感染的十二指肠贾第虫集聚体类型。这无疑提高了检测成本和试验周期。

32、本发明建立的检测方法另一优势是筛选到了最优的rpa引物和crrna，使本发明建立的检测方法灵敏度和特异性更好。rpa引物的扩增效率直接影响了检测方法的灵敏度，crrna则直接关系到检测方法的特异性。经过试验验证，找到了荧光值最高，扩增效果最好，灵敏度最高且特异的rpa引物和crrna。

33、本发明的又一优势是成本低，不依赖于昂贵的仪器设备。目前常用的巢式pcr和荧光定量pcr法，所需的pcr仪和荧光定量pcr仪价格都比较昂贵（pcr仪3万左右，紫外凝胶成像仪6000元，荧光定量pcr仪15万左右）。而本发明建立的检测方法只需要水浴锅或恒温培养箱、蓝光仪或手持蓝光灯即可，所有仪器加起来不过万元，非常适合用于一线现场检测，也为一些偏远地区的检测提供了新方法。

34、本发明的优势还有检测时间短，整个反应过程：rpa扩增20min，crispr/cas12a荧光检测25min，1h之内就能完成检测。巢式pcr则通常需要5-6h才能完成检测，因此本发明建立的检测方法更有利于十二指肠贾第虫的早期快速检测和防控。