异柠檬酸脱氢酶突变体及其应用的制作方法

本公开涉及基因工程领域，具体地说，涉及一种异柠檬酸脱氢酶突变体及其在生产柠檬酸中的应用。

背景技术：

1、柠檬酸是一种非常重要的有机酸，广泛应用于食品工业和日化行业等。目前工业上使用发酵法生产柠檬酸。高产柠檬酸菌种选育在发酵工业中占有重要的地位，几十年来柠檬酸生产菌种黑曲霉的选育研究一直是研究人员所关注的焦点。

2、柠檬酸作为中心代谢的中间代谢产物，正常生理条件下柠檬酸受到严格的代谢调控机制会被代谢分解，不会在胞内得到大量积累。而黑曲霉能够在低ph条件下生产和快速积累柠檬酸，依靠胞内复杂的代谢网络对这一过程进行精细调控。黑曲霉柠檬酸代谢的调节主要包括三个方面：糖酵解途径调节、tca循环调节和能荷的调节。黑曲霉柠檬酸代谢的变化都是由酶驱动的，酶水平的调节即胞内分子水平的调节，属于细胞内最基本的代谢调节方式，酶水平的调节包含酶活性的调节和酶浓度的调节。酶活性的调节作为一种快速调节，包括酶的共价修饰、反馈抑制和别构效应。酶浓度的调节属于基因表达调节，属于慢速调节。酶活性的调节作为一种快速和精确的调控，在上述三种调节方式中发挥重要的作用，使得黑曲霉胞内代谢能适应内外环境不同的变化，柠檬酸得以在胞内得到大量积累。

3、因此，需要开发新的方法和菌株，以期提高生产柠檬酸的产量。

技术实现思路

1、本公开的目的是提供一种异柠檬酸脱氢酶突变体，并利用此突变体生产柠檬酸。

2、本公开的一方面提供了一种异柠檬酸脱氢酶突变体，相对于野生型异柠檬酸脱氢酶，在第142和/或196位氨基酸处具有突变；其中，野生型异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

3、在一些实施方式中，所述异柠檬酸脱氢酶突变体具有q142t(第142位谷氨酰胺突变为苏氨酸)和/或h196l(第196位组氨酸突变为亮氨酸)的氨基酸突变。

4、在一些实施方式中，所述异柠檬酸脱氢酶突变体具有seq id no:5所示的氨基酸序列，或seq id no:5所示的氨基酸序列经过一个或多个氨基酸添加、删除、替换或修饰形成的具有同等功能的氨基酸序列。

5、在一些实施方式中，所述野生型异柠檬酸脱氢酶为出发菌株黑曲霉(aspergillusniger)fy2010(购于中国农业微生物菌种保藏中心，保藏编号accc30161)的异柠檬酸脱氢酶(氨基酸序列和核苷酸序列分别如seq id no:1和seq id no:2所示)

6、本公开的另一方面提供了编码上述异柠檬酸脱氢酶突变体的核酸分子。

7、在一些实施方式中，所述核酸分子具有seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seqid no:6所示的核苷酸序列互补的序列，或与seq id no:6所示的核苷酸序列具有95％、95.5％、96％、96.5％、97％、97.5％、98％、98.5％、99％、99.5、99.8％或99.9％以上同源性的序列。

8、本公开的又一方面提供了含有上述核酸分子的重组表达载体。

9、本公开的又一方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞含有上述的核酸分子或重组表达载体。

10、在一些具体实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)。优选地，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)菌株。

11、本公开的又一方面提供了用于pcr扩增编码所述异柠檬酸脱氢酶突变体基因的引物对，所述引物对包括：

12、正向引物：5′-gatcgagctcatggctaccgaaatctcc-3′(seq id no:3)，反向引物：5′-gatcgcggccgcttagaggcgggacttgag-3′(seq id no:4)。

13、本公开的又一方面提供了上述异柠檬酸脱氢酶突变体、上述核酸分子、上述重组表达载体、或上述宿主细胞在生产或催化生产柠檬酸中的应用。

14、本公开的异柠檬酸脱氢酶突变体用于柠檬酸生产时能够提高发酵生产柠檬酸的产量。

15、本公开的又一方面提供了一种生产柠檬酸的方法，所述方法包括将底物与上述的异柠檬酸脱氢酶突变体接触，或者与表达所述异柠檬酸脱氢酶突变体的宿主细胞接触，进行发酵反应，生成柠檬酸。

16、在一些实施方式中，所述底物为玉米粉和淀粉酶的发酵产物，

17、在一些实施方式中，所述宿主细胞为黑曲霉。

18、在一些实施方式中，所述发酵反应的条件包括以下的至少一者：发酵温度为35-40℃，优选为36-38℃；发酵时间为40-80h，优选为50-70h；溶氧在40％以上；罐压为0.06-0.10mpa。

19、本公开进一步提供所述异柠檬酸脱氢酶突变体的构建方法，包括以下步骤：

20、(1)采用pcr方法从黑曲霉(aspergillusniger)的基因组dna中扩增异柠檬酸脱氢酶(idh)的编码基因idh；

21、(2)采用易错pcr技术，以idh的编码基因idh为模板，扩增获得idh突变体基因；

22、(3)将步骤(2)所得易错pcr产物及表达质粒pet28a(+)用saci和noti双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞进行扩增，获得构建得到重组idh基因突变体库；

23、(4)随机挑取突变菌株进行表达，测定黑曲霉野生型和突变型的idh酶活，挑选酶活力最低的一株作为异柠檬酸脱氢酶突变体，并测定其基因序列。

24、在一些具体实施方式中，所述构建方法包括以下步骤：

25、(1)从黑曲霉(aspergillusniger)fy2010(购于中国农业微生物菌种保藏中心，保藏编号accc30161)基因组dna中，扩增异柠檬酸脱氢酶(idh)的编码基因idh；

26、(2)采用易错pcr技术，以idh的编码基因idh为模板，扩增获得idh突变体基因；

27、(3)将步骤(2)所得易错pcr产物及表达质粒pet28a(+)用saci和noti双酶切后连接，连接产物转入大肠杆菌bl21(de3)感受态细胞，涂布至含kan的lb平板，将平板置37℃恒温培养箱培养，即得构建得到重组idh基因突变体库；

28、(4)含kan的lb平板上长出菌落，挑取其中的100个单克隆，转接到含kan的lb液体培养基中，37℃摇床培养，待菌液od600长至0.8时，加入终浓度为0.2mm的iptg诱导，37℃摇床继续培养12h后，收集菌体，超声破碎，测定黑曲霉(fy2010)和突变体idh酶活，挑选酶活力最低的一株作为异柠檬酸脱氢酶突变体，并测定其基因序列。

29、将通过上述方法获得的含idh突变体基因的黑曲霉进行柠檬酸发酵，提高了柠檬酸的产量和/或产率。

技术特征：

1.一种异柠檬酸脱氢酶突变体，其特征在于，相对于野生型异柠檬酸脱氢酶，所述异柠檬酸脱氢酶突变体在第142和/或196位氨基酸处具有突变，其中，野生型异柠檬酸脱氢酶的氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.根据权利要求1所述的异柠檬酸脱氢酶突变体，其特征在于，所述异柠檬酸脱氢酶的突变体突变氨基酸位点包括q142t和/或h196l，

3.编码权利要求1或2所述异柠檬酸脱氢酶突变体的核酸分子。

4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子具有seq id no:6所示的核苷酸序列，或与seq id no:6所示的核苷酸序列互补的序列，或与seq id no:6所示的核苷酸序列具有95％以上同源性的序列。

5.含有权利要求3或4所述核酸分子的重组表达载体。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞含有权利要求3或4所述的核酸分子或权利要求5所述的重组表达载体。

7.根据权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌(escherichia coli)，优选为大肠杆菌(escherichia coli)bl21(de3)菌株。

8.用于pcr扩增权利要求1或2所述异柠檬酸脱氢酶突变体编码基因的引物对，所述引物对包括：

9.权利要求1或2所述的异柠檬酸脱氢酶突变体、权利要求3或4所述的核酸分子、权利要求5所述的重组表达载体、权利要求6或7所述的宿主细胞在生产或催化生产柠檬酸中的应用。

10.一种生产柠檬酸的方法，其特征在于，所述方法包括将底物与权利要求1或2所述的异柠檬酸脱氢酶突变体接触，或者与表达所述异柠檬酸脱氢酶突变体的宿主细胞接触，进行发酵反应，生成柠檬酸，

技术总结
本发明公开了一种异柠檬酸脱氢酶突变体及其在生产柠檬酸中的应用。该异柠檬酸脱氢酶突变体相对于野生型异柠檬酸脱氢酶在第142和/或196位氨基酸处具有突变。利用本发明提供的异柠檬酸脱氢酶突变体能够提高柠檬酸的产量和产率。

技术研发人员：穆晓玲,杨金环,陈思弘,王芳,魏洁,毕端端
受保护的技术使用者：安徽丰原发酵技术工程研究有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16