可视化快速检测假禾谷镰孢菌RAA-LFD试剂盒、引物组合物及其应用

本发明申请涉及分子生物学检测，具体涉及一种可视化快速检测假禾谷镰孢raa-lfd试剂盒、引物组合物及其应用。

背景技术：

1、小麦田土壤中存在有多种镰孢菌，包括植物致病和非致病镰孢菌，主要有假禾谷镰孢（ f. pseudograminearum）、禾谷镰孢（ f. graminearum）、木贼镰孢（ f. equiseti）、亚洲镰孢( f. asiaticum)、尖镰孢（ f. oxysporum）、层出镰孢( f. proliferatum)、藤仓镰孢( f. fujikuroi)，黄色镰孢（ f. culmorum）。除此以外还有一些常见土壤真菌，如麦根腐平脐蠕孢（ bipolaris sorokiniana）、嘴突蠕孢 (exserohilum rostratum)、玉蜀黍平脐蠕孢（ b.maydis）、大斑凸脐蠕孢( e. turcicum)、稻平脐蠕孢[ b.oryzae(breda de haan)shoemaker]、炭色长蠕孢( helminthosporium carbonum)、玉米弯孢叶斑病菌[ curvularia  lunata（walk） boed]、禾谷丝核菌( rhizoctonia cerealis )等。

2、其中，假禾谷镰孢是一种土壤传播的真菌，主要引起小麦烂种、死苗、茎基部褐变和枯白穗等症状，也是导致赤霉病的病原之一。近些年在我国大部分小麦种植区发生普遍，危害程度日益增加。在黄淮麦区的河南北部、山东大部、河北中南部等地一些麦田因茎基腐病损失率达50%以上，部分地块几乎绝收。而这一类早期症状隐蔽，不容易被发现和准确鉴定，导致生产上防治不及时，防控效果不佳。

3、假禾谷镰孢的检测方法主要包括：①菌落形态及显微镜检测：将植物组织或培养基中的疑似假禾谷镰孢进行制片，在显微镜下观察其形态、结构和特征。假禾谷镰孢在pda培养基上气生菌丝发达，白色或粉红色，绒状，能产生深红色的色素，菌落背面呈桃红色至深红色。康乃馨叶片培养基一般不产生小型分生孢子和厚垣孢子，大型分生孢子镰刀形，无色，多为4～6个隔膜，大小27～91μm×2.7～5.5μm；有性阶段子囊壳呈球形、暗黑色；子囊棍棒状，子囊孢子呈梭形或镰刀形，一般有3个隔膜，间隔处有轻微收缩，大小22～40×4.4～5.0μm；②分子生物学检测：利用假禾谷镰孢的特异性基因序列，设计引物或探针，通过聚合酶链式反应（pcr）或探针杂交等技术，检测样品中是否存在假禾谷镰孢的基因组dna。

4、但现有的假禾谷镰孢检测方法还存在许多不足之处：①检测周期长：现有的检测方法需要经过样品采集、前处理、培养、鉴定等多个步骤，检测周期较长，不利于快速诊断和及时采取防控措施；②灵敏度不高：仅通过形态和显微观察很难准确鉴定假禾谷镰孢；③检测设备昂贵，操作不方便：pcr检测需要购买pcr仪，价格高；而且需要进行琼脂糖凝胶电泳，使用eb等高毒的生化试剂，操作不方便。

5、重组酶介导链替换核酸扩增技术（recombinase-aid amplification，raa技术），是一种在恒温核酸快速扩增技术。在常温下，重组酶可与引物dna紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板dna上搜索到与之完全匹配的互补序列时，在单链dna结合蛋白的帮助下，打开模板 dna的双链结构，并在dna聚合酶的作用下，形成新的dna互补链，扩增产物以指数级增长。该技术具有灵敏度高、特异性强、反应时间短、稳定性好、对设备要求低等优点，现已广泛应用到病毒、细菌、支原体、寄生虫等的快速检测中。侧流层析试纸条（lateral flow dipstick，lfd）是一种可视化观察扩增产物的端点检测技术，raa扩增的双标记产物通过抗原抗体结合作用，在检测线位置形成“荧光素抗体-双标记核酸扩增产物-胶体金复合体”，5min后可直接肉眼观察结果。结合raa扩增与lfd检测技术的raa-lfd方法具有良好的特异性与灵敏度、结果易读、对设备与实验操作人员要求低，适用于非实验室环境的快速检测。目前尚未见raa-lfd技术应用于快速检测假禾谷镰孢的报道。

6、公开该部分的信息仅用于加深对背景技术的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成本领域技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本技术旨在建立假禾谷镰孢的raa-lfd快速检测方法，以解决现有检测方法难以从种类繁多且高度相似的镰孢菌中，简便快速可视化鉴定出强致病力的假禾谷镰孢的技术问题。

2、根据本公开的一个方面，提供一种用于假禾谷镰孢检测的引物，其核苷酸序列如下：

3、ef-f：5'-gacaaaatttttacggctttgtcgtaattt-3'；

4、ef-r：5'-tagacatgttagtatgagaatgtgatgagga-3'。

5、根据本公开的另一个方面，提供一种raa-lfd试剂盒，含有所述引物及核苷酸序列如下所示的探针：

6、raa-p：5'-gagctcggtaagggttccttcaagtacgcctggttcttgacaagctc-3'。

7、在本公开的一些实施例中，所探针5'端以抗原标记物标记，3'端以阻断基因修饰，且在探针第32～33碱基之间设碱基替代物dspcacer。

8、在本公开的一些实施例中，所述抗原标记物为6-fam，所述阻断基因为c3-spacer，所述碱基替代物dspcacer为四氢呋喃。

9、在本公开的一些实施例中，所述raa试剂盒为raa-nfo试剂盒。

10、所述raa-lfd试剂盒在假禾谷镰孢检测或鉴定中的应用。

11、根据本公开的再一个方面，提供一种假禾谷镰孢raa-lfd快速检测方法，包括如下步骤：

12、（1）采用ctab法分别提取待检测真菌基因组dna，得dna样品；

13、（2）建立含有所述引物及探针的反应体系，对dna样品进行重组酶聚合酶扩增；

14、（3）再以hybridetect侧向流试纸条检测所得产物，进而判断是否存在假禾谷镰孢。

15、在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，反应体系由上游引物ef-f、下游引物ef-r、探针raa-p、dna样品、a buffer、b buffer、反应干粉及水构成。

16、在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，重组酶聚合酶扩增在34℃～40℃下进行。

17、在本公开的一些实施例中，在所述步骤（2）中，重组酶聚合酶扩增时间为20～25min。

18、本技术实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

19、1. 结合长期实践研究及大量的筛选试验，发现1对基于假禾谷镰孢 ef-1a基因序列而设计的raa引物，具有非常好的特异性和稳定性，能够从众多具有相似特性的镰孢中有效地区别鉴定出假禾谷镰孢。

20、2. 进一步综合考量raa-lfd引物和探针的设计原则，将所筛选得到的raa引物进一步设计成适用于raa-lfd试剂盒的引物，并在其适合的位置设计探针，再通过侧流纸层析试纸条检测特异性扩增结果，建立了灵敏性、特异性好且操作简便的假禾谷镰孢raa-lfd快速检测方法。