副鸡禽杆菌MLST分子分型的引物组及其应用

本发明提供了一种副鸡禽杆菌mlst分子分型的引物组及其应用，涉及病原菌分子分型技术，属于微生物分型。

背景技术：

1、鸡传染性鼻炎是由副鸡禽杆菌引起的急性上呼吸道传染病，该病主要引起育成鸡生长不良、产蛋鸡产蛋率下降(10-80％)以及死亡率增加(2-10％)。副鸡禽杆菌常用的分型方法是page血清型分型，分为a、b、c三种血清型。传染性鼻炎在全世界多个国家流行，包括美国、英国、德国、印度、巴西和印度尼西亚等。我国于1987年首次发现传染性鼻炎并逐渐流行，近年来，传染性鼻炎发病率持续升高，为养殖业带了巨大的经济损失。传染性鼻炎在国内的流行情况呈现多样化趋势，对流行菌株的溯源分析有利于阐明副鸡禽杆菌在我国的感染状况，这对于制定传染性鼻炎科学的防控措施有重要意义。

2、多位点序列分型(mlst)是通过pcr方法扩增5～10个管家基因的核苷酸序列，并根据序列的碱基差异对细菌进行分型的方法。mlst是许多生物体常用的分型方法，广泛应用于细菌的微进化、群体生物学和流行病学等方面的研究。公共数据库(pubmlst)的开发使细菌物种内进化关系的序列分析和鉴定更为简便。该方法具有操作简单、重复性好及分辨率高等特点，不仅能对不同实验室的结果数据进行共享比对，还可进行病原菌的种群结构及进化方面的研究。mlst已成功地用于多种细菌的流行病学调查研究，但目前并没有关于副鸡禽杆菌的多位点序列分型方面的研究。

技术实现思路

1、本发明首次建立副鸡禽杆菌的mlst分型方法，提供一种分子分型的引物组及其应用，所述引物组应用到分子分型方法中能够明确副鸡禽杆菌的遗传多样性，该分型技术能够作为日后开展副鸡禽杆菌进化分析研究的技术储备。

2、本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：

3、一种用于副鸡禽杆菌mlst分子分型的引物组，所述引物组为管家基因的扩增引物，所述管家基因包括pmi、infb、mdh、adk、deod、reca和zwf；

4、扩增所述管家基因pmi的引物包括pmi-f和pmi-r，所述pmi-f的核苷酸序列如seqid no.1所示，所述pmi-r的核苷酸序列如seq id no.2所示；

5、扩增所述管家基因infb的引物包括infb-f和infb-r，所述infb-f的核苷酸序列如seq id no.3所示，所述infb-r的核苷酸序列如seq id no.4所示；

6、扩增所述管家基因mdh的引物包括mdh-f和mdh-r，所述mdh-f的核苷酸序列如seqid no.5所示，所述mdh-r的核苷酸序列如seq id no.6所示；

7、扩增所述管家基因adk的引物包括adk-f和adk-r，所述adk-f的核苷酸序列如seqid no.7所示，所述adk-r的核苷酸序列如seq id no.8所示；

8、扩增所述管家基因deod的引物包括deod-f和deod-r，所述deod-f的核苷酸序列如seq id no.9所示，所述deod-r的核苷酸序列如seq id no.10所示；

9、扩增所述管家基因reca的引物包括reca-f和reca-r，所述reca-f的核苷酸序列如seq id no.11所示，所述reca-r的核苷酸序列如seq id no.12所示；

10、扩增所述管家基因zwf的引物包括zwf-f和zwf-r，所述zwf-f的核苷酸序列如seqid no.13所示，所述zwf-r的核苷酸序列如seq id no.14所示。

11、本发明还提供上述用于副鸡禽杆菌mlst分子分型的引物组在副鸡禽杆菌分型鉴定中的应用。

12、本发明还提供一种副鸡禽杆菌mlst分子分型的方法，提取细菌基因组dna，采用权利要求1所述的引物组进行pcr扩增。

13、进一步的，将扩增的管家基因进行检测和测序，根据测序的结果进行序列比对，获得菌株的st型，对管家基因进行遗传多样性分析，对st型进行系统发育分析和聚类分析。

14、进一步的，对管家基因进行遗传多样性分析，使用dnasp软件计算等位基因的多态性位点分离数、多态性位点分离率和核苷酸多态性。使用mega x计算dn/ds。使用dnasp中的tajima's d进行管家基因的中性检验。

15、进一步的，将同一菌株的7个管家基因按照在基因组上的顺序拼接，在mega x软件中使用muscle进行比对，然后使用软件中的neighbor-joining method方法绘制系统发育树。

16、进一步的，使用goe burst软件进行副鸡禽杆菌st型的聚类分析。

17、进一步的，pcr反应条件为：94℃,10min；94℃30s；56℃1min；72℃1min共30个循环；最后72℃延伸7min。

18、进一步的，pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测。

19、进一步的，pcr的反应体系包括：50μl，50μl体系里含有0.5μleasytaq，5μl 10×buffer，4.0μl 2.5mmol/l dntp，上、下游引物各1.0μl，dna模板4.0μl，用超纯水补足至50μl。

20、一种副鸡禽杆菌mlst分子分型方法，其特征在于，包括如下步骤：

21、(1)按照细菌基因组dna提取试剂盒说明书提取细菌基因组dna。

22、(2)根据genbank数据库中13株副鸡禽杆菌全基因组序列以及实验室分离的44株分离株和2株标准株序列，筛选出7个保守的管家基因为：pmi、infb、mdh、adk、deod、reca、zwf。

23、(3)根据副鸡禽杆菌的全基因组序列信息，在7个管家基因的保守区设计扩增引物，pmi-f、pmi-r、infb-f、infb-r、mdh-f、mdh-r、adk-f、adk-r、deod-f、deod-r、reca-f、reca-r、zwf-f、zwf-r，引物序列信息如表1所示，用优化的pcr反应体系和条件进行扩增；

24、pcr的反应体系为50μl，50μl体系里含有0.5μl easytaq，5μl10×buffer，4.0μl2.5mmol/l dntp，上、下游引物各1.0μl，dna模板4.0μl，用超纯水补足至50μl。

25、pcr的反应条件为：94℃,10min；94℃30s；56℃1min；72℃1min共30个循环；最后72℃延伸7min。

26、(4)pcr产物用1.5％的琼脂糖凝胶电泳检测，条带大小符合的产物进行测序。

27、(5)处理测序得到的序列，使用snapgene软件对测序结果进行多序列比对与分析，获得菌株的st型。

28、(6)使用dnasp软件计算等位基因的多态性位点分离数、多态性位点分离率和核苷酸多态性。使用mega x计算dn/ds。使用dnasp中的tajima's d进行管家基因的中性检验。

29、(7)将同一菌株的7个管家基因按照在基因组上的顺序拼接，在mega x软件中使用muscle进行比对，然后使用软件中的neighbor-joining method方法绘制系统发育树。

30、(8)使用goe burst软件进行副鸡禽杆菌st型的聚类分析。

31、有益效果

32、本发明经过反复试验，筛选7个管家基因，根据两端保守区设计引物进行扩增，根据结果进行比对获得副鸡禽杆菌的st型，绘制系统进化树。本发明方法可用于副鸡禽杆菌分型鉴定、遗传多样性以及流行病学检测。

33、本发明首次建立了副鸡禽杆菌的mlst分型方法，通过一组分型引物对副鸡禽杆菌进行mlst分型；该方法结果明确，具有高质量低成本的特点，通过遗传进化的溯源来监控副鸡禽杆菌的流行趋势，得到的结果能够在各个实验室之间交流结果，分析世界各地的分离株的亲缘关系，监控鸡传染性鼻炎的流行趋势，以达到更加精准的防控。