一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用

本发明涉及生物技术和遗传育种，特别是一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用。

背景技术：

1、番茄的果实品质由外观品质、风味品质、营养品质和加工贮藏品质构成。其中，番茄的风味物质主要指果实中溶于水并且能被味觉器官所感知到的呈味物质的总称，番茄果实中风味物质主要包含可溶性糖、有机酸、游离氨基酸等，它们分别是果实甜味、酸味以及鲜味的来源。由于番茄的品种不一样，他们原始的酸度就是不一样，有些他的原本的口感就是酸的，就像圣女果一样，他口感特别的好，但是有些太甜了，像是一些糖尿病病人不能吃。

2、番茄果实中的可溶性糖主要包含葡萄糖、果糖和蔗糖，其中蔗糖含量很低；而有机酸酸主要包括柠檬酸、苹果酸、酒石酸、草酸，以柠檬酸和苹果酸为主。

3、氨基酸渗透酶(aaps)是植物中存在的转运氨基酸的蛋白家族，在植物吸收转运氨基酸和品质形成中发挥重要作用。水稻中氨基酸渗透酶osaap6通过改变的氨基酸含量正向调控籽粒蛋白含量，而osaap5的下调表达降低了碱性氨基酸和中性氨基酸的含量，从而维持较高的细胞分裂素水平，调控水稻分蘖数，增加水稻产量。氨基酸能够合成植物细胞物质，节省植株自身的热能和光合作用物质，促进碳、氮代谢进程，提高光合作用，进而影响果实中的糖、酸代谢。

4、因此，有必要开发降低果实糖、酸含量的番茄植株。

技术实现思路

1、为了解决上述技术问题，本发明提供了一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用。

2、为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

3、本发明的第一个目的是要提供一种重组质粒的制备方法，包括以下步骤：

4、s1、提取番茄rna，并反转录cdna，利用设计的如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物以cdna为模板进行扩增，获得番茄slaap7基因特异性目的片段；

5、s2、将番茄slaap7基因特异性目的片段构建入ptrv2载体中，得到重组质粒ptrv2-aap7。

6、进一步地，所述番茄slaap7基因特异性目的片段的大小为300bp，核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、进一步地，所述步骤s1中，扩增番茄slaap7基因特异性目的片段的反应体系为：高保真dna聚合酶25μl，上游引物f 2μl，下游引物r 2μl，cdna 1μl，rnase-free ddh2o 20μl；反应程序:98℃5min；98℃30s,56℃30s，72℃60s，35个循环；4℃∞。

8、进一步地，所述步骤s2具体为：将番茄slaap7基因特异性目的片段与终载ptrv2质粒进行双酶切，产物用infusion连接酶链接，即得重组质粒ptrv2-aap7。

9、本发明的第二个目的是要提供一种利用上述方法制备的重组质粒ptrv2-aap7。

10、本发明的第三个目的是要提供一种重组质粒ptrv2-aap7在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

11、1)将重组质粒ptrv2-aap7利用热激发转移到大肠杆菌感受态dh5α；

12、2)使用冻融法将构建好的大肠杆菌感受态dh5α转化至农杆菌感受态gv3101获得重组农杆菌；

13、3)将重组农杆菌转入番茄中，获得slaap7基因沉默番茄植株即果实糖、酸含量降低的番茄植株。

14、进一步地，所述步骤3)具体为：

15、31)用重组农杆菌先后侵染番茄种子和茎，获得基因功能缺失的番茄材料；

16、32)将扩繁后的菌液离心、去上清后，用悬浮液调节od600为0.8-1.0，使用真空泵侵染出芽的番茄种子，侵染后播种至50孔穴盘内；当番茄苗生长至三叶一心，再次用od600为2.7-3.0的菌液通过注射的方式侵染植株茎，注射后遮光处理24h，放入昼夜温度为24℃/16℃的人工气候室内培养。

17、与现有技术相比，本发明通过将扩增的番茄slaap7基因特异性目的片段构建入ptrv2载体中获得重组质粒ptrv2-aap7，然后通过农杆菌介导的方法将重组质粒ptrv2-aap7转入到番茄植株中抑制slaap7的表达，以此获得slaap7基因沉默番茄植株即果实糖、酸含量降低的番茄植株，本发明改变了番茄果实糖、酸含量，并对果菜类蔬菜的果实品质产生了重要影响。

技术特征：

1.一种重组质粒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述番茄slaap7基因特异性目的片段的大小为300bp，核苷酸序列如seq id no.3所示。

3.根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，所述步骤s1中，扩增番茄slaap7基因特异性目的片段的反应体系为：高保真dna聚合酶25μl ，上游引物f 2μl，下游引物r 2μl，cdna 1μl，rnase-free ddh2o 20μl；反应程序:98℃ 5min；98℃ 30s, 56℃30s，72℃ 60s，35个循环；4℃ ∞。

4.根据权利要求1所述的重组质粒的制备方法，其特征在于，将番茄slaap7基因特异性目的片段与双酶切后的终载ptrv2质粒进行连接，即得重组质粒ptrv2-aap7。

5.一种如权利要求1-4任一所述的方法制备的重组质粒ptrv2-aap7。

6.一种如权利要求5所述的重组质粒ptrv2-aap7在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的重组质粒ptrv2-aap7在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用，其特征在于，所述步骤3)具体为：

技术总结
本发明属于生物技术和遗传育种技术领域，具体公开了一种重组质粒及其制备方法和在培育果实糖、酸含量降低的番茄植株中的应用，通过将扩增的番茄SlAAP7基因特异性目的片段构建入pTRV2载体中获得重组质粒pTRV2‑AAP7，然后通过农杆菌介导的方法将重组质粒pTRV2‑AAP7转入到番茄植株中抑制SlAAP7的表达，以此获得SlAAP7基因沉默番茄植株即果实糖、酸含量降低的番茄植株，本发明改变了番茄果实糖、酸含量，并对果菜类蔬菜的果实品质产生了重要影响。

技术研发人员：许涛,张鹤洋,成丽娜,李瑞祯,刘显凤,贺子昊,刘洋,李天来
受保护的技术使用者：沈阳农业大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/16