一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用

本发明属于生物，涉及一种构建生产辣椒素香草壬酰胺的重组大肠杆菌工程菌株的方法及重组菌株和应用。

背景技术：

1、辣椒素是由中长链的脂肪酸（c9 ~ c11）与香兰素胺合成的一类酰胺类物质。天然辣椒素多来源于辣椒。辣椒素是一类物质的总称，成分的具体差异体现在脂肪酸结构上。具体来说，辣椒素有三种类型。第一种类型脂肪酸无侧链且含不饱和双键（如辣椒碱）；第二种类型脂肪酸有侧链（如二氢辣椒碱）；第三种类型脂肪酸无侧链和不饱和双键（如香草壬酰胺）。

2、辣椒素因具有抗氧化和抗菌的特性而常被用作食品防腐剂。辣椒素具有广泛的抑菌和杀菌功能，也是饲料添加剂中抗生素的优良替代品。辣椒素在减轻疼痛、预防癌症和减肥方面可能有潜在的临床医学价值。

3、目前，辣椒素可通过植物提取和化学合成两种方法获得。生物合成对人类生产和生活用品的需求越来越受到青睐。近年来，辣椒素的生物合成机制逐渐被揭示。通过对高辣度辣椒和辣度缺失辣椒品种的遗传分析，揭示了一些参与辣椒素生物合成的关键基因。基于此，建立一种能够以低价原料为底物利用生物转化高效合成辣椒素的生产策略极具吸引力。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种利用壬酸和香兰素胺生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的构建及细胞转化合成条件。本发明提供的技术方案如下：

2、根据本发明的构建生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的方法，包括如下步骤：

3、通过敲除 fade基因和 fadr基因阻断大肠杆菌宿主细胞的脂肪酸β-氧化分解途径，其中 ，所述 fade基因编码氨基酸序列如seq id no:1所示的蛋白质，所述 fadr基因编码氨基酸序列如seq id no:2所示的蛋白质；

4、通过敲除 acrr基因、 crp基因、 dppa基因 、dppa基因 和year基因提高大肠杆菌宿主细胞对脂肪酸耐受能力，其中，所述 acrr基因编码氨基酸序列如seq id no:3所示的蛋白质，所述 crp基因编码氨基酸序列如seq id no:4所示的蛋白质，所述 dppa基因编码氨基酸序列如seq id no:5所示的蛋白质，所述 year基因编码氨基酸序列如seq id no:6所示的蛋白质；

5、表达香草壬酰胺合成酶系编码基因，所述香草壬酰胺合成酶系编码基因包括n-酰基转移酶编码基因和coa链接酶编码基因，所述n-酰基转移酶编码基因来源于 capsicum  annuum、 solanum lycopersicum和 amycolatopsis mediterranei，为 canat基因、 slnat基因或 amnat基因，所述 canat基因编码氨基酸序列如seq id no:7所示的蛋白质，所述 slnat基因编码氨基酸序列如seq id no:8所示的蛋白质，所述 amnat基因编码氨基酸序列如seq idno:9所示的蛋白质，

6、所述coa链接酶编码基因来源于 sphingomonas sp.、 petunia hybrida和 populus  tomentosa，为 spcl基因、 phcl基因、 ptcl基因或 ptmcl基因，所述 spcl基因编码氨基酸序列如seq id no:10所示的蛋白质，所述 phcl基因编码氨基酸序列如seq id no:11所示的蛋白质，所述 ptcl基因编码氨基酸序列如seq id no:12所示的蛋白质，所述 ptmcl基因编码氨基酸序列如seq id no:13所示的蛋白质。

7、根据本发明的构建生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株的方法，其中，所述n-酰基转移酶编码基因为 slnat基因、所述coa链接酶编码基因为 spcl基因；所述n-酰基转移酶编码基因为 slnat基因、所述coa链接酶编码基因为 phcl基因；所述n-酰基转移酶编码基因为 canat基因、所述coa链接酶编码基因为 spcl基因；所述n-酰基转移酶编码基因为 canat基因、所述coa链接酶编码基因为 phcl基因；或者所述n-酰基转移酶编码基因为 canat基因、所述coa链接酶编码基因为 ptcl基因。

8、本发明还提供了通过上述方法构建的生产辣椒素香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株。

9、所述突变型大肠杆菌底盘细胞为阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高对脂肪酸耐受能力的大肠杆菌宿主。

10、进一步地，将上述方法中的n-酰基转移酶和coa链接酶编码基因连接到pcdfdute-1载体上，分别利用各自的启动子进行胞内表达。

11、上述方法中，所述启动子均为t7启动子。

12、根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，所述方法包括如下步骤：以壬酸和香兰素胺为底物，使用诱导后的上述大肠杆菌工程菌株通过细胞转化合成香草壬酰胺。

13、根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，在ph为9.0的甘氨酸-naoh缓冲液中进行细胞转化。

14、根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，在25 ℃下合成香草壬酰胺。

15、根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中， 诱导后的大肠杆菌工程菌株细胞用无菌水清洗2次。

16、根据本发明的生产香草壬酰胺的方法，其中，细胞转化的时间为8小时。

17、本发明的有益技术效果

18、本发明通过阻断脂肪酸β-氧化分解途径及提高菌株对脂肪酸耐受能力，提高了壬酸的利用效率；进一步利用游离的低拷贝质粒在底盘细胞内表达了合成香草壬酰胺的n-酰基转移酶和coa链接酶编码基因并对不同来源基因进行了筛选，构建了可合成香草壬酰胺的大肠杆菌工程菌株。以壬酸和香兰素胺为底物利用细胞转化合成香草壬酰胺，并对生物转化条件进行了优化，香草壬酰胺摇瓶转化产量达到150.7 mg/l，发酵罐水平转化产量达到500.6 mg/l。