检测大肠杆菌H7抗原的杂交瘤细胞及单抗和应用的制作方法

本发明涉及检测领域，具体涉及检测大肠杆菌h7抗原的杂交瘤细胞，还涉及由该杂交瘤细胞分泌的单抗和在制备检测试剂中的应用。

背景技术：

1、肠出血性大肠杆菌(enterohemorrhagic e.coli,ehec)是大肠杆菌的一个致病亚型，其中主要致病菌株为o157:h7血清型，可引起严重食物中毒的感染性腹泻，并引起严重的出血性肠炎而得名。o157:h7大肠杆菌具有感染剂量极低，潜伏期短等特点，其感染后会引发突然的剧烈腹痛和水样腹泻，数天后出现出血性腹泻，并可能发生溶血性尿毒综合症、血栓性血小板减少性紫癜等严重的并发症，若不及时准确干预治疗，随着病情发展死亡率高,给人民健康和社会造成严重危害。ehec感染在世界多地均有报道，并在欧美国家有严重爆发流行病例，因此得到世界各国卫生行政部门和临床医生的高度重视。

2、ehec o157:h7主要通过食源性途径传播，其次为水源和接触传播，其感染传播严重危害着食品安全及人类健康，但目前还缺少有效地治疗手段，因此对o157:h7的预防控制，特别是病原菌的检测就显得尤为重要。我国进出口食品对e.coli o157:h7检测采用的方法是以行业标准snt0973-2010作为依据。常规检测过程是对样品增菌处理后，进行平板划线培养，然后挑取可疑菌落进行形态、染色及血清学试验、生化鉴定等进行判定，该检测过程耗时长达4-7d，难以适应快速检验的要求。因此，需要有一种操作简便、结果准确可靠、可快速检测大肠杆菌o157:h7血清型的试剂。

3、大肠杆菌有着复杂的抗原系统，包括o抗原(菌体抗原)、k抗原(荚膜抗原)、h抗原(鞭毛抗原)、f抗原(菌毛抗原)，这些抗原成分与大肠杆菌致病和分型有着重要关系。其中o抗原和h抗原为大肠杆菌血清型主要的鉴定抗原，o157菌体抗原和h7鞭毛抗原对ehec菌的鉴定至关重要。为了准确特异的检出o157:h7血清型大肠杆菌，就需要优质的大肠杆菌o157和h7单克隆抗体，但目前市面上还缺乏特异灵敏的h7单克隆抗体，这对o157:h7免疫诊断带来一定困难。因此，开发优质的大肠杆菌o157:h7单克隆抗体具有重要的应用市场价值和临床意义。

4、特异灵敏的配对抗体可广泛应用于胶体金试纸、elisa、电化学发光等不同用途的免疫学试验。其中胶体金检测试纸条检测大肠杆菌o157:h7感染，不需要昂贵的设备和训练有素的专业人员，非常适合临床疑似患者快速诊断及食品安全相关快速检测，提高了检测时效性和便捷性。胶体金免疫层析法检测抗原多采用双抗体夹心法，利用免疫金标记技术，以微孔膜为固相载体，实现对样品的定性或半定量检测。首先将已知的特异性单抗或多抗包被于nc膜上作为检测线(t)，可与金标抗体结合的二抗包被于nc膜上作为质控带(c线)。与包被抗体相配对的另一单抗与胶体金结合，吸附于金标垫作为检测信号。干燥的金标垫一端与膜相接，一端与样品垫相连。膜的另一侧粘贴吸水垫。检测时，样品垫上加入液体样品通过毛细管作用向吸水垫的方向移动，经过金标垫时，如标本中有待测抗原，则发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原复合物；样本继续移动到达检测带位置，则与针对不同检测位点的包被抗体再次发生抗原抗体反应，形成金颗粒－抗体－抗原－包被抗体复合物，形成肉眼可见的t线，如样本中无待检抗原或待检抗原的浓度低于检测范围，则不能形成肉眼可见的红色条带。游离的金标结合物或金颗粒－抗体－抗原复合物越过检测带到达质控带，与二抗发生反应，聚集并产生肉眼可见的红色条带(c线)。无论样本中是否含有待检物质，质控带都会出现c线。

5、胶体金免疫层析法可对样品进行单份检测，具有操作便捷、不需要特殊设备和场地的优点。但目前免疫结合胶体金层析法普遍存在一定缺陷，如对样本的敏感度低，质量控制能力不够，批间、批内和不同试剂间变异系数过大等。因此，提高单克隆抗体配对的敏感度和特异性，是弥补免疫结合胶体金层析法缺陷的重要手段。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种检测大肠杆菌h7抗原单克隆抗体杂交瘤细胞id2；本发明的目的之二在于提供所述杂交瘤细胞id2分泌的单克隆抗体id2；本发明的目的之三在于提供所述单克隆抗体id2在制备检测大肠杆菌h7抗原的检测试剂中的应用；本发明的目的之四在于提供含有所述单克隆抗体id2的检测试剂。

2、为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、1、检测大肠杆菌h7抗原单克隆抗体杂交瘤细胞id2，所述杂交瘤细胞id2保藏编号为gdmcc no：63530，保藏日期为2023年06月06日，保藏单位为广东省微生物菌种保藏中心。

4、2、所述杂交瘤细胞id2分泌的单克隆抗体id2。

5、3、所述单克隆抗体id2在制备检测大肠杆菌h7抗原的检测试剂中的应用。

6、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法、免疫荧光层析法、酶联免疫法或化学发光法。

7、4、含有所述单克隆抗体id2的检测试剂。

8、本发明优选的，所述检测试剂的检测原理为胶体金法。

9、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体id2，所述胶体金垫上结合抗体eh3，所述抗体eh3由杂交瘤细胞eh3分泌。

10、本发明优选的，所述检测试剂含有胶体金试纸条，所述胶体金试纸条包括样品垫、胶体金垫、包被了检测t线和质控c线的硝酸纤维素膜，吸收垫互相衔接粘贴在衬底板；所述检测t线包被抗体id2，所述胶体金垫上标记抗体eh3，所述抗体eh3由杂交瘤细胞eh3分泌。

11、优选的，所述质控c线上包被l mg/ml羊抗鼠igg；所述t线上的单抗包被浓度为1mg/ml；所述胶体金标记的抗体按1ml胶体金结合20μg的抗体。

12、优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

13、优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg本发明优选的，所述胶体金垫上的胶体金颗粒采用柠檬酸三钠还原法制备。

14、本发明优选的，所述质控c线包被羊抗鼠igg。

15、本发明的有益效果在于：本发明公开了检测大肠杆菌h7抗原单克隆抗体杂交瘤细胞id2，还公开了由该杂交瘤细胞id2分泌的单克隆抗体，分泌的抗体能够与保藏编号为gdmcc no：63530的杂交瘤细胞株分泌的抗体配对，用于检测大肠杆菌h7抗原具有特异性好和灵敏度高的优点，因此可以制备检测大肠杆菌h7抗原的试剂，也可以与配对抗体开发检测大肠杆菌h7抗原的试剂条，为大肠杆菌h7抗原的检测提供了新的工具。

16、生物材料保藏

17、本发明的大肠杆菌h7抗原单克隆抗体杂交瘤细胞id2保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no：63530，保藏日期为2023年06月06日，分类命名为balb/c小鼠杂交瘤细胞。

18、大肠杆菌h7抗原单克隆抗体杂交瘤细胞株eh3进行保藏，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省科学院微生物研究所，其保藏编号为gdmcc no：63529，保藏日期为2023年06月06日，分类命名为balb/c小鼠杂交瘤细胞。