基于P450基因表达量的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法及其试剂盒

本发明属于生物，具体涉及基于细胞色素p450基因的过表达对二斑叶螨对阿维菌素抗性检测方法。

背景技术：

1、二斑叶螨（ tetranychus urticae）属真螨目、叶螨科、叶螨属，其体色为黄绿色，有时也被称为白蜘蛛，是一种几乎遍布全世界发生并造成为害的重大农业害螨（grbić etal. the genome of  tetranychus urticae reveals herbivorous pest adaptations.nature, 2011, 479(7374): 487-492）。其寄主植物广泛，可为害茄子、菜豆、甜瓜、西瓜、草莓等重要经济作物。二斑叶螨除了卵期以外，其他的三个螨态（成螨、幼螨和若螨）均可通过口针刺吸植物的汁液，造成叶片出现失绿发黄的白色小点，螨口数量增大时可在植株茎叶上出现吐丝结网现象，为害严重者植株叶片会变成灰白色至暗褐色，甚至干枯脱落，或导致整株死亡，缩短结果期等，给农作物健康生长带来经济损失（姬秀枝，等. 蔬菜二斑叶螨的危害及防治. 中国果菜，2007，124 (5): 36）。二斑叶螨分布广泛，群集在叶片背面为害，其体型微小，成螨仅有0.5mm，繁殖周期短、世代重叠、可营孤雌生殖，这些生物学特性也加重了该螨种群的快速扩繁。另外，二斑叶螨对化学药剂能快速产生抗药性，目前，二斑叶螨已对超过93种化学杀虫剂产生了不同程度的抗药性，主要包括有机磷类、拟除虫菊酯类、抗生素类（如阿维菌素）以及一些新型的杀螨剂，如联苯肼酯、丁氟螨酯等（van leeuwen et al.acaricide resistance mechanisms in the two-spotted spider mite  tetranychus  urticae and other important acari: a review. insect biochemistry andmolecular biology, 2010, 40 (8): 563-572; xu, et al. status of pesticideresistance and associated mutations in the two-spotted spider mite, tetranychus urticae, in china. pesticide biochemistry and physiology, 2018,150: 89-96）。

2、阿维菌素abamectin是由日本北里大学大村智等和美国merck公司首先开发的一类具有杀虫、杀螨、杀线虫活性的十六元大环内酯类化合物，由链霉菌中灰色链霉菌 streptomyces avermitilis发酵产生。阿维菌素作为一种神经毒剂，主要通过触杀和胃毒这两种作用方式杀死靶标生物，其中最主要的作用方式是胃毒活性。害虫、害螨取食阿维菌素后，大量的氯离子通过细胞膜上的通道进入细胞膜内，破坏了细胞膜的正常功能，影响了神经系统动作电位的正常传导，使得靶标生物的神经系统受到损害，导致其逐步死亡。

3、二斑叶螨对阿维菌素抗性问题已非常突出，为了更有效的防治二斑叶螨及科学应用阿维菌素，及时明确二斑叶螨种群对阿维菌素的抗性是一个极为重要的基础，目前二斑叶螨对阿维菌素的抗性监测常采用传统的生物测定方法。然而，常用的传统的生物测定方法存在一些明显的缺点：（1）检测周期长：二斑叶螨的生物测定从测试叶片浸药、挑取试虫、结果镜检、死亡试虫判断等一系列过程，需要耗时超过30个小时；（2）试虫需要量大：测定一个标准曲线完成一次生物测定需要500-600头生理状态一致的健康试虫。（3）测试需要熟练工：传统生物测定方法（玻片浸渍法、叶片浸渍法等）比较繁琐，加上叶螨体型极其微小，不易于快速操作，需要熟练工才行，而且从虫源、饲养到测定难以做到真正的标准化，尤其要求试虫生理状态一致，不仅导致工作量加大，而且诸多因素（例如测试叶螨死亡率的判定）也会影响试验结果；（4）结果指导具有滞后性：传统生物测定方法对供试叶螨测得的抗性状况往往具有滞后性，有时需要多次试验才能明确其抗性水平，对于田间指导用药和抗性治理不利；（5）测试灵敏度低：生物测定有时难以快速测定测试种群的早期抗性或低频率抗性。因此，开发二斑叶螨对阿维菌素的早期快速检测预警技术显得尤为重要。目前，一些基于pcr方法的分子标记技术如rapd（random amplified polymorphic dna，随机扩增多态性dna）、aflp（amplified fragment length polymorphism，扩增片段长度多态性）已经用于一些害虫抗性相关基因的研究，但这些技术也受限于引物扩增的重复性差、适宜的酶切位点难找、酶切结果不稳定性等问题。随着分子生物学技术的快速发展，实时荧光定量pcr技术（real time-quantitative polymerase chain reaction, rt-qpcr）作为一种更灵敏的扩增技术，广泛应用于病毒、细菌、植物、动物等不同功能基因的检测，也应用于转录水平上昆虫抗药性靶标基因的表达量检测。实时荧光定量pcr在pcr扩增过程中，通过荧光信号，对pcr扩增进程进行实时检测。由于在pcr扩增的指数时期，模板的阈值循环数ct值（每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数）和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量检测的依据。相对于生物测定等常规抗性检测手段，实时荧光定量pcr具有操作简单、灵敏度高、重复性好等优点，因此成为害虫抗药性靶标基因转录水平表达量检测的重要方法，在抗药性检测上显示出其强大的技术优势。

4、二斑叶螨对阿维菌素的抗药性机制研究，主要涉及靶标抗性和代谢抗性。研究报道，谷氨酸门控氯离子通道（glutamate-gated chloride channel, glucl）中glucl1基因的g314d位点与glucl3基因中的g326e位点突变与二斑叶螨对阿维菌素的抗药性密切相关（kwon et al. a point mutation in a glutamate‐gated chloride channel confersabamectin resistance in the two‐spotted spider mite,  tetranychus urticae koch. insect molecular biology, 2010, 19 (4): 583-591; dermauw et al. thecys-loop ligand-gated ion channel gene family of  tetranychus urticae:implications for acaricide toxicology and a novel mutation associated withabamectin resistance. insect biochemistry and molecular biology, 2012, 42(7): 455-465）。除此之外，对田间阿维菌素抗性的二斑叶螨种群进行增效剂试验，发现胡椒基丁醚（pbo）对两个抗性种群具有显著的增效作用，表明p450解毒酶在二斑叶螨对阿维菌素的抗性形成中发挥关键作用（xu et al. transcriptome profiling and functionalanalysis suggest that the constitutive overexpression of four cytochromep450s confers resistance to abamectin in  tetranychus urticae from china. pestmanag. sci., 2021, 77(3):1204-1213）；而且基于转录组数据结合定量pcr分析发现，在阿维菌素抗性二斑叶螨种群中存在高表达的p450基因 cyp392a11，通过基因干扰试验证明该基因与阿维菌素抗性密切相关（xu et al. transcriptome profiling and functionalanalysis suggest that the constitutive overexpression of four cytochromep450s confers resistance to abamectin in  tetranychus urticae from china. pestmanag. sci., 2021, 77(3):1204-1213）。基于此，建立一种叶螨对阿维菌素抗性检测方法对于二斑叶螨的抗性治理具有极其重要的实践意义。

技术实现思路

1、本发明通过研究发现一个p450基因 cyp392a11（基因序列如seq id no.1所示）在阿维菌素抗性的二斑叶螨种群中呈现明显的过量表达，其异源表达的蛋白可体外代谢阿维菌素，表明该 cyp392a11基因表达量上调与阿维菌素抗性密切相关。基于此，该基因可以作为阿维菌素抗性产生的相关基因，利用实时荧光定量pcr技术检测 cyp392a11表达量的上调水平是一种有效检测田间害螨对阿维菌素抗性的可行方法。二斑叶螨早期抗药性分子检测与诊断技术的开发将为其抗性治理措施的评价以及抗药性风险预警方面提供技术手段，并在减少害虫为害损失、促进合理选药用药、保障蔬菜、果品等农产品的质量安全和保障人民身体健康等方面具有重要的意义。因此，建立这种准确、简便、快速、可靠的二斑叶螨对阿维菌素抗性检测手段具有重要的实践意义。

2、本发明首先提供二斑叶螨细胞色素p450基因在检测或监测二斑叶螨对阿维菌素抗性中的应用。

3、具体地，检测基因的表达量上升，表明二斑叶螨对阿维菌素产生了抗药性。

4、更具体地，其通过用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测试剂盒来进行检测，优选地以二斑叶螨细胞色素p450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，优选地，所述试剂盒包含以下叶螨靶标基因细胞色素p450基因特异性引物序列：上游引物：5'- tccctggtgctgttgatgac-3' （seq id no.2），下游引物：5'-gctcgtaccaagaccgacat-3'（seq id no.3）。

5、本发明因而提供一种用于检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测试剂盒，其包含以下以二斑叶螨细胞色素p450基因为靶目标序列设计得到的靶标基因特异性引物对，优选地，所述试剂盒包含以下叶螨靶标基因细胞色素p450基因特异性引物序列：上游引物：5'- tccctggtgctgttgatgac-3'（seq id no.2），下游引物：5'- gctcgtaccaagaccgacat-3'（seq id no.3）。

6、进一步，所述试剂盒还含有逆转录酶，脱氧核糖核酸酶dnase，rna抑制剂rnase，dntp混合物，基因特异性扩增引物，氯化镁mgcl2溶液，热启动taq dna聚合酶，荧光定量反应液，缓冲液buffer，去rna酶rnase-free水。

7、更进一步地，还包括阳性对照及阴性对照样品，进一步以actin基因作为内参基因设计引物。

8、本发明提供一种检测二斑叶螨对阿维菌素抗性的pcr检测方法，包括以下步骤：

9、（1）提取待测二斑叶螨群体的rna样品，并反转录为cdna模板；

10、（2）将所述cdna模板加入到含有叶螨靶标基因细胞色素p450基因特异性引物对的pcr反应液中得到pcr反应体系；

11、（3）进行实时荧光定量pcr检测；

12、具体地，所述特异性引物对的序列如下：上游引物：5'- tccctggtgctgttgatgac-3'（seq id no.2），下游引物：5'- gctcgtaccaagaccgacat-3'（seq id no.3）。

13、具体地，所述实时荧光定量pcr检测的扩增程序为：95 ℃预变性10 min，95 ℃变性15 sec，60 ℃退火30 sec，72 ℃延伸32 sec，进行40个循环。

14、更优选地，对上述步骤中荧光定量pcr反应产物进行荧光定量检测，在特定的波长条件下，根据荧光检测的二斑叶螨抗性和敏感样品间各自靶标基因 cyp392a11与内参基因actin之间的ct值差值，即△ct值判断结果，若所述待测二斑叶螨样品产生典型的“s”型扩增曲线及单峰融解曲线，且△ct值≤ 5.5，则说明所述二斑叶螨待测样品对阿维菌素产生抗性；若△ct值>6.3，则说明待测二斑叶螨样品未对阿维菌素产生抗性。若△ct值位于两者中间，则建议重做，样品对阿维菌素抗性产生与否视重做结果而定。

15、本发明发现细胞色素p450基因的表达量上升与二斑叶螨对阿维菌素抗性相关，进而针对其非保守片段区为靶目标序列，设计特异性引物，再配合内参基因的特异性引物，建立了一种用于二斑叶螨对阿维菌素抗性检测的实时荧光定量pcr检测方法。即将其作为分子标记辅助实现田间二斑叶螨种群对阿维菌素杀虫剂的早期检测和预警。较之现有生物测定技术而言，本发明具有特异性更强，灵敏度和准确度更高，可以准确、快速、特异、便捷地检出供试二斑叶螨是否对阿维菌素产生了抗性。