一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的无细胞表达系统、试剂盒及其应用的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的无细胞表达系统、试剂盒及其应用。

背景技术：

1、胶原蛋白是维持皮肤、组织和器官形态结构的主要成分，在皮肤、关节和骨骼等生物结构中起连接作用，在食品、医疗、美容等领域应用广泛。胶原蛋白免疫原性较弱，可与血小板相互作用产生凝血现象，加速伤口愈合；还可以与伤口紧密结合，渗透到新的组织中，并作为细胞生长的支架。弹性蛋白是一种富含弹性氨基酸的结构蛋白质，其分子结构呈现出许多交联的纤维状结构，使得弹性蛋白具有高度的弹性和可伸缩性。弹性蛋白主要存在于皮肤、血管、肺泡、肌腱等组织中，是这些组织中重要的结构蛋白质之一。

2、相关技术中，多利用基因工程方法对大肠杆菌、酵母、昆虫细胞和转基因作物等进行修饰以产生胶原蛋白和弹性蛋白。然而，由于胶原蛋白和弹性蛋白分子量大，结构可重复性强，甘氨酸和脯氨酸占比高，故转基因菌株等合成胶原蛋白和弹性蛋白的能力均较弱，使得制备成本极高，市场价格达到每克3～7万美元。

3、因此，需要提供一种合成效率高、成本低的胶原蛋白和弹性蛋白的生产方法。

技术实现思路

1、本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的无细胞表达系统，合成效率高、成本低。

2、本发明还提供一种试剂盒。

3、本发明还提供一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的生产方法。

4、本发明还提供上述无细胞表达系统或试剂盒在生产胶原蛋白和/或弹性蛋白中的应用。

5、根据本发明的第一方面实施例的一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的无细胞表达系统，包括：细胞提取物、核糖核苷酸混合物、氨基酸混合物、缓冲剂、盐离子、能量物质、rna聚合酶、模板；

6、所述模板用于编码所述胶原蛋白和/或弹性蛋白；

7、所述盐离子包括镁离子；

8、所述氨基酸混合物包括甘氨酸和脯氨酸；

9、所述无细胞表达系统中，所述甘氨酸的浓度为5mm～20mm，所述脯氨酸的浓度为5mm～20mm。

10、根据本发明实施例的无细胞表达系统，至少具有如下有益效果：

11、实施例的无细胞表达系统能够高效率、低成本合成胶原蛋白、弹性蛋白。

12、若甘氨酸和脯氨酸浓度过高，会对其他氨基酸会有抑制作用，影响胶原蛋白、弹性蛋白的合成；若甘氨酸和脯氨酸浓度过低，并不会起到提高胶原蛋白、弹性蛋白产量的作用。当甘氨酸和脯氨酸的浓度为5mm～20mm时，能显著提高胶原蛋白、弹性蛋白的产量。

13、根据本发明的一些实施例，所述胶原蛋白包括但不限于人胶原蛋白i、ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x、xi、xii、xiii、xiv、xv、xvi、xvii、xviii、xix、xx、xxi、xxii、xxiii、xxiv、xxv、xxvi、xxvii、xxviii。

14、根据本发明的一些实施例，所述弹性蛋白包括但不限于人弹性蛋白elastin。

15、根据本发明的一些实施例，所述细胞提取物包括大肠杆菌提取物、枯草芽孢杆菌、酵母提取物中的至少一种。

16、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述细胞提取物的浓度为30w/v％～70w/v％。进一步可以为40w/v％～60w/v％。例如：可以为40w/v％、42w/v％、44w/v％、46w/v％、48w/v％、50w/v％、52w/v％、54w/v％、56w/v％、58w/v％或60w/v％。

17、根据本发明的一些实施例，所述核糖核苷酸混合物为合成rna的底物。

18、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述核糖核苷酸混合物的浓度为1mm～3mm。例如：可以为1mm、1.3mm、1.5mm、1.7mm、2mm、2.2mm、2.5mm、2.7mm或3mm。

19、根据本发明的一些实施例，所述氨基酸混合物为合成所述胶原蛋白和/或弹性蛋白的底物。所述氨基酸混合物还包括丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、丝氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、苏氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、赖氨酸、精氨酸、组氨酸中的至少一种。各氨基酸的浓度为0.05mm～0.1mm。例如：可以为0.05mm、0.06mm、0.07mm、0.08mm、0.09mm或0.1mm。

20、根据本发明的一些实施例，所述缓冲剂包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸(hepes)、三羟甲基氨基甲烷(tris)、磷酸盐(pbs)中的至少一种。

21、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统的ph为7.0～8.5。例如：可以为7.0、7.2、7.5、7.8、8.0、8.2或8.5。

22、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述缓冲剂的浓度为10mm～50mm。进一步可以为10mm～30mm。例如：可以为10mm、12mm、14mm、16mm、18mm、20mm、22mm、24mm、26mm、28mm或30mm。

23、根据本发明的一些实施例，所述镁离子的来源包括醋酸镁、氯化镁、磷酸镁、硫酸镁、柠檬酸镁、硝酸镁、草酸镁中的至少一种。

24、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述镁离子的浓度为1mm～10mm。进一步可以为1mm～5mm。例如：可以为1mm、1.5mm、2mm、2.5mm、3mm、3.5mm、4mm、4.5mm或5mm。

25、根据本发明的一些实施例，所述盐离子还包括钾离子、铵离子、钠离子、甜菜碱中的至少一种。

26、根据本发明的一些实施例，所述钾离子的来源包括氯化钾、硫酸钾、硝酸钾、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸氢钾、醋酸钾、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾和柠檬酸钾中的至少一种。

27、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述钾离子的浓度为0mm～300mm。进一步可以为50mm～200mm。更进一步可以为50mm～150mm。例如：可以为50mm、60mm、70mm、80mm、90mm、100mm、110mm、120mm、130mm、140mm或150mm。

28、根据本发明的一些实施例，所述铵离子的来源包括氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、磷酸铵、碳酸铵、碳酸氢铵、磷酸氢二铵、磷酸二氢铵和醋酸铵中的至少一种。

29、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述铵离子的浓度为0mm～50mm。进一步可以为10mm～30mm。例如：可以为10mm、13mm、15mm、17mm、20mm、22mm、25mm、27mm或30mm。

30、根据本发明的一些实施例，所述钠离子的来源包括氯化钠、硫酸钠、硝酸钠、亚硫酸钠、碳酸钠、碳酸氢钠、醋酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠和柠檬酸钠中的至少一种。

31、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述钠离子的浓度为0mm～300mm。进一步可以为10mm～100mm。更进一步可以为30mm～70mm。例如：可以为30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm或70mm。

32、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述甜菜碱的浓度为0～10mm。可用于稳定酶活性。例如：可以为1mm、2mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm或10mm。

33、根据本发明的一些实施例，所述能量物质包括糖类物质。所述糖类物质包括葡萄糖、果糖、甘油、麦芽糊精、乳糖中的至少一种。

34、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述能量物质的浓度为20mm～200mm。进一步可以为20mm～100mm。更进一步可以为30mm～70mm。例如：可以为30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm或70mm。

35、根据本发明的一些实施例，所述rna聚合酶包括t7 rna聚合酶。所述rna聚合酶能够与所述模板反应，转录得到对应的mrna。

36、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述rna聚合酶的浓度为10mg/l～100mg/l。进一步可以为10mg/l～50mg/l。例如：可以为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l或50mg/l。

37、根据本发明的一些实施例，所述模板为能够编码所述胶原蛋白和/或弹性蛋白的dna分子。所述模板还包括启动子、终止子、增强子中的至少一种。例如：所述模板可以由t7启动子介导表达。

38、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述模板的浓度为0.1ng/μl～10ng/μl。例如：可以为0.1ng/μl、1ng/μl、2ng/μl、3ng/μl、4ng/μl、5ng/μl、6ng/μl、7ng/μl、8ng/μl、9ng/μl或10ng/μl。

39、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统还可以包括拥挤剂。

40、根据本发明的一些实施例，所述拥挤剂包括聚乙二醇(peg)、聚乙烯醇、葡聚糖中的至少一种。

41、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述拥挤剂的浓度为0w/v％～5w/v％。进一步可以为1w/v％～3w/v％。例如：可以为1w/v％、1.2w/v％、1.4w/v％、1.6w/v％、1.8w/v％、2w/v％、2.2w/v％、2.4w/v％、2.6w/v％、2.8w/v％或3w/v％。

42、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统还可以包括脯氨酸羟化酶或其编码其的dna分子。

43、胶原蛋白其c-端结构域整齐的三聚体保持稳固的关键是胶原蛋白中羟脯氨酸的羟基可与其他链上氨基酸侧链形成氢键。相关技术中，基因工程相关方法合成的胶原蛋白上的脯氨酸无法经翻译后修饰羟化，得到含三聚体的胶原蛋白极少，品质较差。通过在本发明的无细胞表达系统添加脯氨酸羟化酶，能够显著提高胶原蛋白、弹性蛋白的脯氨酸羟基化修饰水平，有效保证合成的胶原蛋白、弹性蛋白的品质。

44、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述脯氨酸羟化酶的浓度为10mg/l～100mg/l。例如：可以为10mg/l、20mg/l、30mg/l、40mg/l、50mg/l、60mg/l、70mg/l、80mg/l、90mg/l、100mg/l。

45、根据本发明的一些实施例，所述脯氨酸羟化酶可以是微小病毒的脯氨酸羟基化酶l593。编码所述脯氨酸羟化酶的dna分子还包括启动子、终止子、增强子中的至少一种。例如：其可以由t7启动子介导表达。所述脯氨酸羟化酶的核苷酸序列如seq id no.3所示。

46、根据本发明的一些实施例，所述无细胞表达系统中，所述编码脯氨酸羟化酶的dna分子的浓度为0.1-1mg/l。例如：可以为0.1mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1mg/ml。

47、根据本发明的第二方面实施例的一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的表达试剂盒，包括上述无细胞表达系统。由于表达试剂盒采用了上述实施例的无细胞表达系统的全部技术方案，因此至少具有上述实施例的技术方案所带来的所有有益效果。

48、根据本发明的第三方面实施例的一种胶原蛋白和/或弹性蛋白的制备方法，包括以下步骤：

49、将上述无细胞表达系统孵育反应，即得所述胶原蛋白和/或弹性蛋白。

50、根据本发明的一些实施例，所述孵育反应的温度为30℃～40℃。例如：可以为30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃或40℃。

51、根据本发明的一些实施例，所述孵育反应的时间为4h～21h。

52、根据本发明的一些实施例，所述生产方法还可以包括分离和/或检测所述胶原蛋白和/或弹性蛋白。

53、根据本发明的第四方面实施例的上述无细胞表达系统或表达试剂盒在生产胶原蛋白和/或弹性蛋白中的应用。

54、本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。