穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白及其制备方法和应用与流程

本发明属于肉毒杆菌毒素制剂领域，具体涉及一种穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白及其制备方法和应用。

背景技术：

1、人体随着年龄的增长，皮肤细胞会因多种因素，如污染物、强紫外线、应激、营养不足等而受损，导致皮肤皱纹、皮肤弹性损失和皮肤角质化。随着人们对美的追求欲望增强，对于具有特定美容效果(减少皱纹)的产品消费量也逐年增加，功能性化妆品、医美产品的价值进一步提升。

2、皮肤的角质层细胞是皮肤的一道天然屏障，可以防止水分蒸发，让皮肤保持在一个水润饱满，同时组织外界细菌入侵，抵抗外界各种刺激。但是，同时皮肤角质层会阻止分子量为500da或更低分子量的化合物到达细胞。

3、肉毒杆菌毒素是由革兰氏阳性细菌肉毒梭菌产生的神经毒素，其通过阻止突触传递或乙酰胆碱通过神经肌肉接头的释放来使肌肉产生麻痹，因此，肉毒杆菌毒素可用于治疗痉挛、强直等疾病。自1992年报道肉毒杆菌毒素在治疗眼肌痉挛时具有消除皱纹的作用，自此开创了肉毒杆菌毒素在美容领域的应用。2002年4月fda批准肉毒杆菌毒素可以用于化妆品中。目前肉毒杆菌毒素的主要给药途径为皮下注射或肌肉注射，通过向面部肌肉内注射起到去除皱纹的治疗效果。注射使用时，肉毒杆菌毒素在临床的使用的安全性存在一定问题，微小剂量就可能致死。

4、专利文献cn 114989271a公开一种重组a型肉毒素，所述重组a型肉毒素毒性高，在具体的蛋白毒力测定实验中，所述蛋白的半数致死量(ld50)为4.023pg/只。专利文献cn106414759a中公开肉毒神经毒素是已知最强效的毒素，小鼠的中位数致死剂量(ld50)值范围从0.5ng/kg至5ng/kg。从现有技术公开的内容可以看到，常规肉毒杆菌毒素毒性高，半数致死量小，临床使用安全性较低。

技术实现思路

1、为了解决现有技术的问题，本发明提供一种穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白及其制备方法和应用，所述穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白使用较大剂量才有致死性，安全性高。

2、本发明包括如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白，所述重组蛋白的序列选自下列氨基酸序列中的一种：

4、a)所述重组蛋白由seq id no:1的氨基酸序列组成；

5、b)所述重组蛋白是与seq no:1的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性程度的序列；

6、c)所述重组蛋白的氨基酸序列与seq no:1的氨基酸的差异不超过10、9、8、7、6、5、4、3、2或不超过1个。

7、seq id no:1氨基酸序列如下：

8、mhhhhhhpfvnkqfnykdpvngvdiayikipnagqmqpvkafkihnkiwviperd

9、tftnpeegdlnpppeakqvpvsyydstylstdnekdnylkgvtklferiystdlgrmll

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15、nnmnftklknftglfealgpcmlllllllglrlpgvwapprrrrrrrrr

16、第二方面，本发明提供一种编码所述穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列。

17、所述核苷酸序列可以是rna或dna，并且所述dna包括cdna和合成dna。所述dna可以是单链或双链。单链dna可以是编码链或非编码(反义)链。所述编码序列可编码seq id no:1氨基酸序列组成的重组蛋白。

18、在本发明的一个具体实施例中，所述核苷酸序列由seq id no:2所示的核苷酸序列组成。

19、seq id no:2核苷酸序列如下：

20、gatcccatgcatcatcatcatcaccatccgtttgttaataagcagtttaattacaaggacccggttaatggtgttgatattgcctatattaagatcccgaatgccggtcagatgcagccggtgaaagcctttaaaattcataataagatctgggttattccggaacgcgatacctttaccaatccggaagaaggtgacctgaatccgccgccggaagccaaacaggtgccggtgagctattatgatagtacctatctgagtaccgataatgaaaaagataactatctgaagggtgttaccaaactgtttgaacgcatctatagtaccgatctgggtcgcatgctgctgaccagtattgttcgtggtattccgttttggggcggcagcaccattgataccgaactgaaagttattgataccaattgcattaacgtgattcagccggatggcagttatcgcagtgaagaactgaatctggttattattggtccgagcgcagatattattcagtttgaatgcaaaagtttcggccatgaagttctgaatctgacccgcaatggctatggcagcacccagtatattcgctttagcccggattttacctttggctttgaagaaagcctggaagttgataccaatccgctgctgggtgccggtaaatttgccaccgatccggcagtgaccctggcacatgaactgattcatgcaggtcatcgcctgtatggtattgccattaatccgaatcgtgtgtttaaagttaacaccaatgcctattatgagatgagcggcctggaagtgagctttgaagaactgcgtacctttggtggccatgatgcaaaattcattgatagcctgcaggaaaatgaatttcgtctgtattattacaacaagttcaaggatatcgccagtaccctgaataaggccaaaagcattgtgggtaccaccgcaagtctgcagtatatgaaaaatgtttttaaggagaagtacctgctgagcgaagataccagtggtaaattttctgttgataaactgaagttcgacaaactgtataaaatgctgaccgaaatctataccgaagataattttgttaagttcttcaaggtgctgaatcgcaaaacctatctgaattttgataaggcagtgtttaagattaacatcgtgccgaaagtgaattataccatctatgatggctttaatctgcgcaataccaatctggcagccaattttaatggccagaataccgaaattaacaatatgaatttcaccaagctgaagaatttcaccggtctgtttgaagcactgggtccgtgcatgctgctgctgctgttactgctgggtctgcgcctgccgggtgtgtgggcacctcctcgtcgccgtcgtcgtcgtcgccgtagataa

21、第三方面，本发明提供一种重组蛋白表达载体，所述表达载体中包括编码穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白的核苷酸序列。所述重组蛋白表达载体能在宿主细胞中表达穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白，其是包含可操作连接以表达基因插入片段的必要调控因子的基因构建物。

22、在本发明的一个实施例中，所述重组蛋白表达载体由seq id no:3所示的核苷酸序列组成。

23、seq id no:3核苷酸序列如下：

24、tggcgaatgggacgcgccctgtagcggcgcattaagcgcggcgggtgtggtggttacgcgcagcgtgaccgctacacttgcagcgccctagcgcccgctcctttcgctttcttcccttcctttctcgccacgttcgccggctttccccgtcaagctctaaatcgggggctccctttagggttccgatttagtgctttacggcacctcgaccccaaaaaacttgattagggtgatggttcacgtagtgggccatcgccctgatagacggtttttcgccctttgacgttggagtccacgttctttaatagtggactcttgttccaaactggaacaacactcaaccctatctcggtctattcttttgatttataagggattttgccgatttcggcctattggttaaaaaatgagctgatttaacaaaaatttaacgcgaattttaacaaaatattaacgtttacaatttcaggtggcacttttcggggaaatgtgcgcggaacccctatttgtttatttttctaaatacattcaaatatgtatccgctcatgagacaataaccctgataaatgcttcaataatattgaaaaaggaagagtatgagtattcaacatttccgtgtcgcccttattcccttttttgcggcattttgccttcctgtttttgctcacccagaaacgctggtgaaagtaaaagatgctgaagatcagttgggtgcacgagtgggttacatcgaactggatctcaacagcggtaagatccttgagagttttcgccccgaagaacgttttccaatgatgagcacttttaaagttctgctatgtggcgcggtattatcccgtattgacgccgggcaagagcaactcggtcgccgcatacactattctcagaatgacttggttgagtactcaccagtcacagaaaagcatcttacggatggcatgacagtaagagaattatgcagtgctgccataaccatgagtgataacactgcggccaacttacttctgacaacgatcggaggaccgaaggagctaaccgcttttttgcacaacatgggggatcatgtaactcgccttgatcgttgggaaccggagctgaatgaagccataccaaacgacgagcgtgacaccacgatgcctgcagcaatggcaacaacgttgcgcaaactattaactggcgaactacttactctagcttcccggcaacaattaatagactggatggaggcggataaagttgcaggaccacttctgcgctcggcccttccggctggctggtttattgctgataaatctggagccggtgagcgtgggtctcgcggtatcattgcagcactggggccagatggtaagccctcccgtatcgtagttatctacacgacggggagtcaggcaactatggatgaacgaaatagacagatcgctgagataggtgcctcactgattaagcattggtaactgtcagaccaagtttactcatatatactttagattgatttaaaacttcatttttaatttaaaaggatctaggtgaagatcctttttgataatctcatgaccaaaatcccttaacgtgagttttcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgtccttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcacatgttctttcctgcgttatcccctgattctgtggataaccgtattaccgcctttgagtgagctgataccgctcgccgcagccgaacgaccgagcgcagcgagtcagtgagcgaggaagcggaagagcgcctgatgcggtattttctccttacgcatctgtgcggtatttcacaccgcatatatggtgcactctcagtacaatctgctctgatgccgcatagttaagccagtatacactccgctatcgctacgtgactgggtcatggctgcgccccgacacccgccaacacccgctgacgcgccctgacgggcttgtctgctcccggcatccgcttacagacaagctgtgaccgtctccgggagctgcatgtgtcagaggttttcaccgtcatcaccgaaacgcgcgaggcagctgcggtaaagctcatcagcgtggtcgtgaagcgattcacagatgtctgcctgttcatccgcgtccagctcgttgagtttctccagaagcgttaatgtctggcttctgataaagcgggccatgttaagggcggttttttcctgtttggtcactgatgcctccgtgtaagggggatttctgttcatgggggtaatgataccgatgaaacgagagaggatgctcacgatacgggttactgatgatgaacatgcccggttactggaacgttgtgagggtaaacaactggcggtatggatgcggcgggaccagagaaaaatcactcagggtcaatgccagcgcttcgttaatacagatgtaggtgttccacagggtagccagcagcatcctgcgatgcagatccggaacataatggtgcagggcgctgacttccgcgtttccagactttacgaaacacggaaaccgaagaccattcatgttgttgctcaggtcgcagacgttttgcagcagcagtcgcttcacgttcgctcgcgtatcggtgattcattctgctaaccagtaaggcaaccccgccagcctagccgggtcctcaacgacaggagcacgatcatgcgcacccgtggggccgccatgccggcgataatggcctgcttctcgccgaaacgtttggtggcgggaccagtgacgaaggcttgagcgagggcgtgcaagattccgaataccgcaagcgacaggccgatcatcgtcgcgctccagcgaaagcggtcctcgccgaaaatgacccagagcgctgccggcacctgtcctacgagttgcatgataaagaagacagtcataagtgcggcgacgatagtcatgccccgcgcccaccggaaggagctgactgggttgaaggctctcaagggcatcggtcgagatcccggtgcctaatgagtgagctaacttacattaattgcgttgcgctcactgcccgctttccagtcgggaaacctgtcgtgccagctgcattaatgaatcggccaacgcgcggggagaggcggtttgcgtattgggcgccagggtggtttttcttttcaccagtgagacgggcaacagctgattgcccttcaccgcctggccctgagagagttgcagcaagcggtccacgctggtttgccccagcaggcgaaaatcctgtttgatggtggttaacggcgggatataacatgagctgtcttcggtatcgtcgtatcccactaccgagatatccgcaccaacgcgcagcccggactcggtaatggcgcgcattgcgcccagcgccatctgatcgttggcaaccagcatcgcagtgggaacgatgccctcattcagcatttgcatggtttgttgaaaaccggacatggcactccagtcgccttcccgttccgctatcggctgaatttgattgcgagtgagatatttatgccagccagccagacgcagacgcgccgagacagaacttaatgggcccgctaacagcgcgatttgctggtgacccaatgcgaccagatgctccacgcccagtcgcgtaccgtcttcatgggagaaaataatactgttgatgggtgtctggtcagagacatcaagaaataacgccggaacattagtgcaggcagcttccacagcaatggcatcctggtcatccagcggatagttaatgatcagcccactgacgcgttgcgcgagaagattgtgcaccgccgctttacaggcttcgacgccgcttcgttctaccatcgacaccaccacgctggcacccagttgatcggcgcgagatttaatcgccgcgacaatttgcgacggcgcgtgcagggccagactggaggtggcaacgccaatcagcaacgactgtttgcccgccagttgttgtgccacgcggttgggaatgtaattcagctccgccatcgccgcttccactttttcccgcgttttcgcagaaacgtggctggcctggttcaccacgcgggaaacggtctgataagagacaccggcatactctgcgacatcgtataacgttactggtttcacattcaccaccctgaattgactctcttccgggcgctatcatgccataccgcgaaaggttttgcgccattcgatggtgtccgggatctcgacgctctcccttatgcgactcctgcattaggaagcagcccagtagtaggttgaggccgttgagcaccgccgccgcaaggaatggtgcatgcaaggagatggcgcccaacagtcccccggccacggggcctgccaccatacccacgccgaaacaagcgctcatgagcccgaagtggcgagc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25、第四方面，本发明提供一种经重组蛋白表达载体转化的细菌，培养所述转化细菌能获得穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白。

26、第五方面，本发明提供一种组合物，所述组合物中包括穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白以及药学上可接受的载体。

27、所述组合物选自以下制剂：乳剂、霜剂、精华、润肤液、脂质体、微胶囊剂、复合颗粒、洗发香波、洗剂。

28、第六方面，本发明提供一种生产穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白的方法，所述方法包括如下步骤：

29、(1)采用pcr方法扩增穿膜肽与肉毒杆菌毒素的基因片段，将合成的目的基因与大肠杆菌表达质粒pet-25b连接；

30、(2)将重组的表达质粒转化至dh5α感受态细胞中，筛选阳性克隆并进行测序，获得重组蛋白表达载体；

31、(3)抽提经测序鉴定正确的重组质粒转化至rosetta感受态细胞中，并存于甘油菌中，利用氯霉素和氨苄青霉素抗性筛选出构建成功的转化子，iptg诱导获得重组蛋白；

32、(4)将重组蛋白进行分离纯化，得到穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白。

33、可选地，所述步骤(2)中使用氨苄青霉素和氯霉素筛选阳性克隆。

34、可选地，所述步骤(3)具体包括如下操作：

35、s1：取甘油菌于lb固体培养基上画线，37℃过夜培养，所述lb固体培养基中包括浓度为50μg/ml的氨苄青霉素和浓度为15μg/ml的氯霉素；

36、s2：随机挑取3个单克隆于3ml的2yt液体培养基中，加入浓度为30mg/ml的氯霉素溶液和100mg/ml的氨苄青霉素钠溶液，在37℃的条件下以220rpm的转速进行摇菌，过夜培养，得到细菌培养液；

37、s3：将过夜培养的菌液1:50转接于3ml 2yt液体培养基中，于37℃摇床培养，待菌液od600值为0.4-0.8时，加入终浓度为0.5-1mm iptg，在16-20℃的条件下以220rpm的转速诱导12-24h，收集菌体，用loading buffer处理菌体后，并用sds-page跑胶验证；

38、s4：将蛋白表达量高的菌液1：50接种于2yt液体培养基中，加入浓度为15mg/ml的氯霉素溶液和浓度为50mg/ml的氨苄青霉素钠溶液，在37℃的条件下以220rpm的转速进行摇菌，od600值为0.4-0.8时，加入终浓度为0.5-1mm的iptg，16-20℃，220rpm，诱导过夜；

39、s5：收集诱导过夜的菌液，10000rpm，离心10-16min，收集菌体，用pbs重悬细胞并通过超声处理进行裂解细胞，根据菌体量的多少选择2号杆或者10号杆，功率30％，超声5s，间隔5s，总共超声处理30min，整个过程在冰上进行；至菌体完全重悬没有细胞沉在管底，收集上清液，4℃，10,000rpm离心30分钟，除去细菌碎片获得上清液。

40、第七方面，本发明提供一种穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白和/或含有穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白的组合物的用途，包括如下任意一种中的用途：

41、(1)预防和/或治疗面肌痉挛、眼皮痉挛、斜颈、眼睑痉挛、颈部肌张力障碍、口咽部肌张力障碍、痉挛性发音障碍、偏头痛、肛门瘙痒症、多汗症；

42、(2)改善皱纹、鼻唇线、鱼尾纹、嘴角纹、抬头纹、皮肤损伤、皮肤软化、疤痕、痤疮。

43、本发明提供的穿膜肽肉毒杆菌毒素重组蛋白优势在于，其安全性更高，使用较大剂量才具有致死性。