RAA荧光法检测耐药基因arr2的引物、探针、试剂盒与应用

本发明涉及生物检测，尤其涉及raa荧光法检测耐药基因arr2的引物、探针、试剂盒与应用。

背景技术：

1、近年来，由于抗生素耐药现象的广泛存在导致病原菌的耐药性的增强。铜绿假单胞菌为假单胞菌科常见条件致病菌，也是三甲医院重症监护室传染的主要致病菌，分布广泛，在正常情况下不致病，但当人体抵抗力较弱时，铜绿假单胞菌的感染率增加。人体感染铜绿假单胞菌后，会造成肺部、泌尿道、伤口、血液(如败血病)、眼部等多处感染及肺炎等疾病。由于铜绿假单胞菌可附着在隐形眼镜表面形成生物膜，生长能力极强，难以处理，在隐形眼镜清洁不彻底的情况下，极易发生眼睛角膜感染，严重时可导致失明。针对于铜绿假单胞菌耐药基因快速高效的检测方式有利于阻止疾病的传播及临床诊治方案的制定。

2、目前实验室和临床平台对于病原菌的检测方法包括以下几种类型：传统检测方法(涂片显微镜观察、细菌分离培养)、免疫学方法(依赖于抗原与抗体的特异性结合)、分子生物学方法(基因芯片技术、核酸杂交技术、dna测序技术、基于pcr的各类技术、新型分子检测技术等)。传统检测方法能直接对病原菌涂片染色，进而镜检的过程简便快速，但耗费的时间较长且需要复杂的仪器及专业的检测平台，并不适用于基础实验平台及偏远地区的检测。而新型分子检测技术lamp技术是2000年由日本研究人员notomi等开发的一种新型的体外等温扩增特异核酸片段的技术，该技术利用两对特殊引物和具有链置换活性的bstdna聚合酶，使反应中在模板两端引物结合处循环出现环状单链结构，在等温条件下使引物顺利与模板结合并进行链置换扩增反应，但该技术需要多对引物进行环等温扩增，增加了检测的复杂程度。

3、基于重组酶介导的等温扩增技术raa，取代传统聚合酶链反应，最早由英国剑桥twistdx公司开发，目前由江苏奇天基因生物科技有限公司开发的重组酶辅助扩增技术已成为鉴定多种病原体的分子工具。raa是建立在rpa基础上的检测方法，不同在于，rpa的关键成分是t4噬菌体的重组酶uvsx，而raa的重组酶(sc-reca，bs-reca，rad51)是从大肠杆菌中获得的，可以在室温下与引物dna紧密结合。raa技术利用单链结合蛋白、dna聚合酶和重组酶在等温(38～41℃)条件下进行核酸扩增，当反应体系中加入荧光探针后，能够进行实时检测，实现检测结果在5-20分钟输出，灵敏度较高。

4、基于上述内容，如果能够将raa荧光法应用在铜绿假单胞菌耐药基因的检测上，将提高耐药基因的检测效率和灵敏度。

技术实现思路

1、有鉴于此，本发明的目的是提供raa荧光法检测耐药基因arr2的引物、探针、试剂盒与应用，有效提高了铜绿假单胞菌耐药基因arr2的检测效率和灵敏度。

2、本发明通过以下技术手段解决上述技术问题：

3、本发明的第一方面在于提供了一种raa荧光法检测耐药基因arr2的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq id no.2所示。

4、本发明的第二方面在于提供了一种raa荧光法检测耐药基因arr2的探针，包括如seq id no.3所示序列的探针，或者在seq id no.3所示序列基础上经修饰的探针。

5、结合第二方面，在一些实施方式中，所述修饰为在距离探针序列5’端大于等于35nt的中间位置标记一个四氢呋喃碱基位点作为核酸外切酶的识别位点i，两边分别添加t碱基，5’端的t添加fam荧光基团，3’端的t添加淬灭基团，由核酸外切酶识别并切割thf位点。

6、本发明的第三方面在于提供了一种raa荧光法检测耐药基因arr2的试剂盒，所述试剂盒包含上述的引物，和/或上述的探针。

7、结合第三方面，在一些实施方式中，所述试剂盒还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有铜绿假单胞菌耐药基因arr2的基因组dna，所述阴性质控品为ddh2o或纯化水。

8、本发明的第四方面在于提供了上述引物或者探针或者试剂盒，在体外检测样品中是否存在铜绿假单胞菌耐药基因arr2的应用，所述应用为非诊断目的的。

9、结合第四方面，在一些实施方式中，所述引物在反应体系中的终浓度独立地为10μmol/l，所述探针在反应体系中的终浓度为10μmol/l。

10、本发明具有以下有益效果：

11、(1)本发明反应检测靶标dna的灵敏度高，最低检验限可低至10copies/μl，且设计的引物具有高度特异性；

12、(2)在基础反应单元中引入荧光探针，即可实现结果的定时定量可视化分析，探针设计在引物中间的序列，整个反应过程简便快速，阴阳性的变化通过荧光扩增曲线观察其差异性，简单便捷，且避免反应后开盖造成的气溶胶污染；

13、(3)本发明在检测铜绿假单胞菌耐药基因arr2时，在等温条件下即可进行，只需要恒温环境和能够检测fam的荧光检测仪，降低了实验所需要的人工成本和仪器成本；

14、(4)本发明的探针含有荧光报告基团和淬灭基团，并在距离5’端大于等于35nt的中间位置标记一个四氢呋喃碱基位点(thf)作为核酸外切酶的识别位点i，两边添加两个t碱基，5’端的t添加fam荧光基团，3’端的t添加淬灭基团，由核酸外切酶识别并切割thf位点，当thf与靶序列结合被限制性内切酶切断，两个基团将分离，发出信号，在具有荧光检测功能的仪器中荧光信号被收集并快速检测，具有很强的灵敏性。

技术特征：

1.raa荧光法检测耐药基因arr2的引物，所述引物包括上游引物和下游引物，其特征在于，所述上游引物的核苷酸序列如seq id no.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如seq idno.2所示。

2.raa荧光法检测耐药基因arr2的探针，其特征在于，包括如seq id no.3所示序列的探针，或者在seq id no.3所示序列基础上经修饰的探针。

3.根据权利要求2所述的raa荧光法检测耐药基因arr2的探针，其特征在于，所述修饰为在距离探针序列5’端大于等于35nt的中间位置标记一个四氢呋喃碱基位点作为核酸外切酶的识别位点i，两边分别添加t碱基，5’端的t添加fam荧光基团，3’端的t添加淬灭基团，由核酸外切酶识别并切割thf位点。

4.raa荧光法检测耐药基因arr2的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的引物，和/或权利要求2或3所述的探针。

5.根据权利要求4所述的raa荧光法检测耐药基因arr2的试剂盒，其特征在于，还包括阳性质控品和阴性质控品，所述阳性质控品为含有铜绿假单胞菌耐药基因arr2的基因组dna，所述阴性质控品为ddh2o或纯化水。

6.权利要求1所述的引物或者权利要求2或3所述的探针或者权利要求4或5所述的试剂盒，在体外检测样品中是否存在铜绿假单胞菌耐药基因arr2的应用，所述应用为非诊断目的的。

7.根据权利要求6所述的应用，所述引物在反应体系中的终浓度独立地为10μmol/l，所述探针在反应体系中的终浓度为10μmol/l。

技术总结
本发明涉及生物检测技术领域，公开了RAA荧光法检测耐药基因arr2的引物、探针、试剂盒与应用，所述引物包括上游引物和下游引物，所述上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，探针包括如SEQ ID NO.3所示序列的探针，或者在SEQ ID NO.3所示序列基础上经修饰的探针。本发明有效提高了铜绿假单胞菌耐药基因arr2的检测效率和灵敏度。

技术研发人员：陈耀东,周瑶
受保护的技术使用者：西北大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15