一种高效表达限制性内切酶MlUI的方法

本发明属于生物工程，具体涉及一种高效表达限制性内切酶mlui的方法。

背景技术：

1、限制性内切酶与甲基化酶是当代基因研究的重要工具，通常从不同的微生物中获得，前者负责降解进入原核细胞的外源dna，后者则对细胞自身的dna进行甲基化，从而保护细胞的dna，使其不被细胞内的限制性核酸内切酶降解。由于限制酶包含200多个品种，来源完全不同，相互之间无直接关联，研发工作无法举一反三；并且，限制性核酸内切酶可专一性地识别并水解双链dna上的特异核苷酸顺序，对宿主细胞来说是毒性蛋白，在过表达时会导致宿主细胞死亡而无法得到目标蛋白，因此制备限制性内切酶具有较高的技术难度。

2、现有技术中生产限制性内切酶的方法主要是将限制-修饰基因克隆入质粒，靠质粒的高拷贝数实现目的蛋白高表达，而且使用的是与限制性内切酶对应的特异性甲基化酶进行制备，这种方法的提纯程序繁琐、生产成本高，如何降低生产成本，制备高纯度的限制性内切酶成为亟待解决的技术难题。

技术实现思路

1、本发明的目的在于针对现有技术的不足，提出一种高效表达限制性内切酶mlui的方法，获得纯度高、活性高的限制性内切酶mlui，降低生产成本。

2、本发明提供了一种高效表达限制性内切酶mlui的方法，包括以下步骤：

3、将mlui基因转化到er2566菌株中，培养含有mlui基因的er2566菌株，得到mlui菌培养液；

4、利用iptg诱导所述mlui菌培养液，纯化，得到限制性内切酶mlui。

5、优选的，所述将mlui基因转化到er2566菌株中的方式包括：将mlui基因和基础质粒重组，得到重组质粒后转化er2566菌株。

6、优选的，所述基础质粒包括pet-28a。

7、优选的，所述iptg的浓度为0.1mm～1mm。

8、优选的，诱导的条件为16℃～37℃，200～250rpm；所述诱导的时间为4～18h。

9、优选的，所述纯化采用ni亲和层析柱。

10、优选的，所述纯化的步骤包括：

11、取经iptg诱导后的mlui菌培养液，离心收集菌体；

12、利用ni柱结合缓冲液重悬所述菌体，破碎，离心取上清，利用ni亲和层析纯化柱，依次利用平衡缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2和洗脱缓冲液进行洗脱，分别收集利用平衡缓冲液、漂洗缓冲液1、漂洗缓冲液2和洗脱缓冲液洗脱后的洗脱液，合并后透析；

13、所述透析所得透析液中含有限制性内切酶mlui；

14、所述ni柱结合缓冲液的ph为7.4，其组成包括：20mm tris-hcl、100mm nacl；

15、所述平衡缓冲液的ph为7.4，其组成包括：20mm tris-hcl、100mm nacl；

16、所述漂洗缓冲液1的ph为7.4，其组成包括：20mm tris-hcl、100mm nacl、10mm咪唑；

17、所述漂洗缓冲液2的ph为7.4，组成包括：20mm tris-hcl、100mm nacl、30mm咪唑；

18、所述洗脱缓冲液的ph为7.4，其组成包括：20mm tris-hcl、100mm nacl、300mm咪唑。

19、有益效果：

20、er2566是bl21的部分基因组序列替换为k-12的同源序列后所得菌株。引入k-12的6％基因组序列后，er2566的表型不同于bl21，表现为耐受非特异性核酸酶所引起的dna损伤，并且er2566菌株的cds序列存在甲基化酶和甲基转移酶，(例如dna adenine methylase以及dna adenine methylase等，能使细菌dna分子中的腺嘌呤发生甲基化，形成6’-甲基腺嘌呤，保护细胞自身的dna不被限制性内切酶破坏)，直接将mlui基因转化至er2566菌株，构建含有mlui基因的工程菌，er2566菌株本身的甲基化酶可以保护宿主dna免于宿主细胞内限制性内切酶的切割，无需另外转入甲基化酶筛选，大大简化了表达过程。本发明方法在保证酶活的基础上简化了实验方法，降低了生产成本，为大规模工业化生产mlui提供了有益的理论及实践依据。

21、进一步的，本发明以pet-28a为基础载体，由于pet-28a具有6x his纯化标签编码序列，最终表达的重组蛋白上含有6x his纯化标签，极大地简化了目的蛋白的纯化工作。

技术特征：

1.一种高效表达限制性内切酶mlui的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述将mlui基因转化到er2566菌株中包括：将mlui基因和基础质粒重组，将得到的重组质粒转化入er2566菌株。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述基础质粒包括pet-28a。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述iptg在培养液中的浓度为0.1mm～1mm。

5.根据权利要求1或4所述的方法，其特征在于，所述诱导的条件为16℃～37℃，200～250rpm；所述诱导的时间为4～18h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为ni亲和层析柱层析。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述纯化包括以下步骤：

技术总结
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种高效表达限制性内切酶MlUI的方法。具体步骤包括：将MlUI基因转化到ER2566菌株中，培养含有MlUI基因的ER2566菌株，得到MlUI菌培养液；利用IPTG诱导所述MlUI菌培养液，纯化，得到限制性内切酶MlUI。本发明直接使用菌株ER2566，无需转入甲基化酶进行筛选，大大简化了表达过程，在保证酶活的基础上简化了实验方法，降低了生产成本，为大规模工业化生产MlUI提供了有益的理论及实践依据，并且得到的限制性内切酶MlUI具有高纯度与高活性。

技术研发人员：王申林,刘小乐,刘蔓,何津涵
受保护的技术使用者：华东理工大学
技术研发日：
技术公布日：2024/1/15