促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物与流程

本披露内容涉及产生含非天然氨基酸的多肽的细胞系的基因组工程化和产生的领域。本发明总体上涉及细胞系的产生、开发和含非天然氨基酸的多肽和蛋白质的产生的领域。

背景技术：

1、化学正交定向的工程化系统在真核细胞中的应用(eucode)(feng等人,(2013),ageneral approach to site-specific antibody drug conjugates[位点特异性抗体药物缀合物的一般方法],pnas[美国国家科学院院刊]111(5):1766-1771；schultz等人,uspn7,083,970，各自通过引用并入本文)是基因地产生含有非天然氨基酸的蛋白质方面的突破。近年来，这项技术已经在抗体药物缀合(adc)领域中取得了快速的发展(参见例如，美国专利申请号20150018530、20150141624、20150152187和20150152190)，各自通过引用并入本文。然而，在哺乳动物细胞中相对较低的产量阻碍了含非天然氨基酸的蛋白质在工业中更广泛的应用。

2、观察结果表明，可能导致蛋白质产生的产量低的主要因素可能是由系统中过量的不带电trna引起的诱导的细胞凋亡。如本领域已知的，细胞凋亡可以由在细胞培养(包括生产过程)中的各种内在或外在因素引发。导致蛋白质产生的产量低的其他挑战是能够在生物反应器过程中放大时激活固有的凋亡途径的细胞应激物。因此，在工业上需要用于促进和增加含非天然氨基酸的蛋白质产生的改进的方法和组合物。本发明披露内容满足了这些和其他需求，如通过阅读以下披露内容所显而易见的。

技术实现思路

1、本文披露了用于促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的方法和组合物。本文还披露了用于促进含非天然氨基酸的蛋白质产生的细胞和细胞系。在一个实施例中，本发明披露内容提供了一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞系的方法，该方法包括在表达含选择密码子的目的基因的细胞中一个或多个靶向失活的位点或区域，其中细胞包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)。在另一个实施例中，该细胞或细胞系是真核的。在其他实施例中，该细胞或细胞系选自cos、cho、vero、mdck、wi38、v79、b14af28-g3、bhk、hak、ns0、sp2/0-ag14、hela或hek293。在一个其他实施例中，该细胞或细胞系是瞬时的、稳定的细胞群或稳定的克隆细胞系。在另一个实施例中，该细胞是分离的细胞。该分离的细胞用于获得掺入非天然氨基酸的蛋白质。

2、在另一个实施例中，本发明包括掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽。在其他实施例中，该非天然氨基酸是位点特异性掺入的。在另一个实施例中，该非天然氨基酸是对乙酰基苯丙氨酸、对硝基苯丙氨酸、对磺基酪氨酸、对羧基苯丙氨酸、邻硝基苯丙氨酸、间硝基苯丙氨酸、对硼羰基(p-borony)苯丙氨酸、邻硼羰基苯丙氨酸、间硼羰基苯丙氨酸、对氨基苯丙氨酸、邻氨基苯丙氨酸、间氨基苯丙氨酸、对酰基苯丙氨酸、邻酰基苯丙氨酸、间酰基苯丙氨酸、对ome苯丙氨酸、邻ome苯丙氨酸、间ome苯丙氨酸、对磺基苯丙氨酸、邻磺基苯丙氨酸、间磺基苯丙氨酸、5-硝基his、3-硝基tyr、2-硝基tyr、硝基取代的leu、硝基取代的his、硝基取代的de、硝基取代的trp、2-硝基trp、4-硝基trp、5-硝基trp、6-硝基trp、7-硝基trp、3-氨基酪氨酸、2-氨基酪氨酸、邻磺基酪氨酸、2-磺基氧基苯丙氨酸、3-磺基氧基苯丙氨酸、邻羧基苯丙氨酸、间羧基苯丙氨酸、对乙酰基-l-苯丙氨酸、对炔丙基-苯丙氨酸、o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸或对炔丙基氧基-苯丙氨酸。在本发明的一些实施例中，该非天然氨基酸选自o-甲基-l-酪氨酸、l-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、o-4-烯丙基-l-酪氨酸、4-丙基-l-酪氨酸、对炔丙基氧基-l-苯丙氨酸、三-o-乙酰基-glcnacβ-丝氨酸、左旋多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-l-苯丙氨酸、对叠氮基-l-苯丙氨酸、对酰基-l-苯丙氨酸、对苯甲酰基-l-苯丙氨酸、l-磷酸丝氨酸、膦酰基丝氨酸、膦酰基酪氨酸、对碘-苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-l-苯丙氨酸或异丙基-l-苯丙氨酸。

3、在其他实施例中，本发明提供了一种目的基因或含选择密码子的目的基因。该选择密码子是无义密码子、稀有密码子或四碱基密码子。在另一个实施例中，该选择密码子包含赭石密码子、乳白石密码子或琥珀密码子。在某些实施例中，该选择密码子是琥珀密码子。

4、在本发明的实施例中，该目的基因或含选择密码子的目的基因是包括疫苗的生物治疗基因或产物或者抗体。该目的基因或含选择密码子的目的基因是抗体、scfv、scfv融合蛋白、fc融合蛋白、因子vii、因子viii或因子iv。在其他实施例中，该目的基因或含选择密码子的目的基因是细胞因子、白细胞介素、干扰素、趋化因子、生长因子、激素、及其受体、类似物、双特异物或片段。在另一个实施例中，该目的基因是her2、cd-70、psma、5t4、egfr、trop2、cd3、il-2、il-3、il-10、il-15、gpc3、dll3、ror1、瘦素、fgf-21、fgf-23、hgh、fcr、胰岛素、tnfr1、trail、epo、及其类似物、双特异物或片段。在其他实施例中，该目的基因或含选择密码子的目的基因选自由以下组成的组：细胞因子、生长因子、生长因子受体、干扰素、白细胞介素、炎症分子、致癌基因产物、肽激素、信号转导分子、甾体激素受体、红细胞生成素(epo)、胰岛素、人生长激素、α-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗体、载脂蛋白、脱辅基蛋白、心房利钠因子、心房利钠多肽、心房肽、c-x-c趋化因子、t39765、nap-2、ena-78、gro-a、gro-b、gro-c、ip-10、gcp-2、nap-4、sdf-1、pf4、mig、降钙素、c-kit配体、细胞因子、cc趋化因子、单核细胞趋化蛋白-1、单核细胞趋化蛋白-2、单核细胞趋化蛋白-3、单核细胞炎症蛋白-1α、单核细胞炎症蛋白-1β、rantes、i309、r83915、r91733、hcc1、t58847、d31065、t64262、cd40、cd40配体、c-kit配体、胶原蛋白、集落刺激因子(csf)、补体因子5a、补体抑制剂、补体受体1、细胞因子、dhfr、上皮嗜中性粒细胞激活肽-78、groα/mgsa、groβ、groγ、mip-1α、mip-1δ、mcp-1、上皮生长因子(egf)、上皮嗜中性粒细胞激活肽、红细胞生成素(epo)、脱落毒素(exfoliating toxin)、因子ix、因子vii、因子viii、因子x、成纤维细胞生长因子(fgf)、纤维蛋白原、纤连蛋白、g-csf、gm-csf、葡糖脑苷脂酶、促性腺激素、生长因子、生长因子受体、刺猬蛋白(hedgehog protein)、血红蛋白、肝细胞生长因子(hgf)、水蛭素、人血清白蛋白、icam-1、icam-1受体、lfa-1、lfa-1受体、胰岛素、胰岛素样生长因子(igf)、igf-i、igf-ii、干扰素、ifn-α、ifn-β、ifn-γ、白细胞介素、il-1、il-2、il-3、il-4、il-5、il-6、il-7、il-8、il-9、il-10、il-11、il-12、角质细胞生长因子(kgf)、乳铁蛋白、白血病抑制因子、萤光素酶、神经秩蛋白、嗜中性粒细胞抑制因子(nif)、制瘤素m、成骨蛋白、致癌基因产物、甲状旁腺素、pd-ecsf、pdgf、肽激素、人生长激素、多效调理素(pleiotropin)、蛋白质a、蛋白质g、致热外毒素a、b或c、松弛素、肾素、scf、可溶性补体受体i、可溶性i-cam 1、可溶性白细胞介素受体、可溶性tnf受体、生长调节素、生长抑素、生长激素、链激酶、超抗原、葡萄球菌肠毒素、sea、seb、sec1、sec2、sec3、sed、see、甾体激素受体、超氧化物歧化酶(sod)、毒性休克综合征毒素、胸腺素α1、组织纤酶溶原激活物、肿瘤生长因子(tgf)、tgf-α、tgf-β、肿瘤坏死因子、肿瘤坏死因子α、肿瘤坏死因子β、肿瘤坏死因子受体(tnfr)、vla-4蛋白、vcam-1蛋白、血管内皮生长因子(vegef)、尿激酶、mos、ras、raf、met、p53、tat、fos、myc、jun、myb、rel、雌激素受体、孕酮受体、睾酮受体、醛固酮受体、ldl受体、scf/c-kit、cd40l/cd40、vla-4/vcam-1、icam-1/lfa-1、透明素(hyalurin)/cd44和皮质酮。

5、在其他实施例中，本发明提供了一个或多个靶向失活、消融、破坏或敲除的位点或区域。该一个或多个靶向失活的位点或区域是gs、bcl-2、igfbp4、aqp1、maf1、erf1、fut8、p53、半胱天冬酶3、upf1、smg1、smac/diablo、apaf-1、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、parp、α胞衬蛋白、numa、aif、cad、puma、noxa、14-3-3、aven、myc或htra2/omi。在一个实施例中，该靶向失活的位点或区域是非固有选择标记基因。在另一个实施例中，该选择标记基因是博莱霉素、潮霉素或嘌呤霉素。在另一个实施例中，该靶向失活的位点或区域是bcl-2位点或区域。在另一个实施例中，该靶向失活的位点或区域是bax或bak。在其他实施例中，该靶向失活的位点或区域被完全或部分失活。部分失活、破坏、敲除或消融的位点或区域可以包括1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、21％、22％、23％、24％、25％、26％、27％、28％、29％、30％、31％、32％、33％、34％、35％、36％、37％、38％、39％、40％、41％、42％、43％、44％、45％、46％、47％、48％、49％、50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％失活、破坏、敲除或消融的位点或区域。

6、在另一个实施例中，本发明提供了一种用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞或细胞系，该细胞表达含选择密码子的目的基因，其中该目的基因包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)；并且其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域。

7、在另一个实施例中，本发明提供了一种用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞或细胞系，该细胞或细胞系包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)、正交抑制型trna(o-trna)，并且其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域。

8、在其他实施例中，本发明提供了一种表达目的基因的细胞或细胞系，该目的基因包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)、正交抑制型trna(o-trna)，其中该细胞包含一个或多个靶向失活的位点或区域。

9、在另一个实施例中，本发明提供了一种降低或减少包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)的细胞中的细胞凋亡的方法，该方法包括使在该细胞中的一个或多个促凋亡位点或区域靶向失活。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于降低或减少细胞或细胞系中的细胞凋亡的细胞或细胞系。

10、在另一个实施例中，本发明提供了一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞的方法，该方法包括：提供能够使细胞中的一个或多个靶向失活的位点或区域失活的核酸分子，该细胞表达含选择密码子的目的基因；以及将该核酸分子引入表达该含选择密码子的目的基因的细胞中，该目的基因包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)。在其他实施例中，该核酸分子选自seq.id no.1-42。在另一个实施例中，该核酸分子使一个或多个靶向失活的位点或区域失活。在一个其他实施例中，该一个或多个靶向失活的位点或区域是相同或不同的。

11、在另一个实施例中，本发明提供了一种用于改进掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽的产量的方法或细胞或细胞系。在一些实施例中，该细胞是瞬时的、稳定的细胞群或稳定的克隆细胞。在本发明的另一个实施例中提供了一种用于降低或减少细胞中的细胞凋亡的方法。在另一个实施例中，本发明提供了一种用于改进位点特异性掺入非天然氨基酸的蛋白质或多肽的产量的方法。

12、在另一个实施例中，本发明提供了一种产生包含非天然氨基酸的细胞系的方法，该方法包括：提供表达含选择密码子的目的基因的细胞系，该目的基因包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)；将能够使该细胞中的一个或多个靶位点失活的核酸分子引入该细胞中；以及向该细胞提供非天然氨基酸。

13、在其他实施例中，本发明提供了一种产生用于将非天然氨基酸掺入蛋白质的细胞的方法，该方法包括：提供能够使细胞中的一个或多个靶向失活的位点或区域失活的核酸分子；以及将该核酸分子引入包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)的该细胞中。

14、在另一个实施例中，本发明提供了一种根据权利要求中任一项所述的分离的细胞或细胞系。在其他实施例中，本发明提供了一种用于获得稳定的细胞或细胞系的方法，其中该细胞系包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)。在其他实施例中，该稳定的细胞或细胞系平台或生产细胞或细胞系。

15、在另一个实施例中，本发明提供了一种用于优化生产细胞系的开发的方法，其中该细胞系包含正交氨酰基trna合成酶(o-rs)和正交抑制型trna(o-trna)。在一个其他实施例中，本发明提供了一种包含非天然氨基酸的分离的多肽。在另一个实施例中，本发明提供了一种细胞或细胞系，其中与不存在使细胞中的一个或多个靶向失活的位点或区域失活的情况相比，该含非天然氨基酸的蛋白质的产量是至少0.5倍或更高。

16、在本发明的一个实施例中，将一种或多种工程化核酸分子引入该细胞系中。该一种或多种工程化核酸分子可以包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种工程化核酸分子。在其他实施例中，该一种或多种工程化核酸分子来自相同或不同的靶位点或区域。在一些实施例中，这些工程化核酸分子可以包括来自细胞中的相同靶位点或区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种工程化核酸分子。在一些实施例中，这些工程化核酸分子可以包括来自不同的靶位点或区域的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10种或更多种工程化核酸分子。

17、在其他实施例中，识别细胞中的一个或多个靶向失活、消融、敲除或破坏的位点或区域的多核苷酸可以包括识别1、2、3、4、5、6、7、8、9、10个或更多个位点或区域的多核苷酸。

18、在其他实施例中，提供了细胞或细胞系。在某些实施例中，提供了稳定的生产细胞系。在其他实施例中，该细胞或细胞系是真核细胞或细胞系。在其他实施例中，该真核细胞或细胞系可以包括例如哺乳动物细胞、酵母细胞、真菌细胞、植物细胞、昆虫细胞中的任何一种，但不限于此。在一些实施例中，该真核生物细胞或细胞系是脊椎动物细胞或细胞系。在一些实施例中，该真核生物细胞或细胞系是哺乳动物或人细胞或细胞系。在其他实施例中，该细胞或细胞系可以包括cos、cho(例如，cho-s、cho-k1、cho-dg44、cho-duxb11、cho-dukx、chok1sv)、vero、mdck、wi38、v79、b14af28-g3、bhk、hak、ns0、sp2/0-ag14、hela或hek293(例如，hek293-f、hek293-h、hek293-t)细胞或细胞系，但不限于此。在其他实施例中，该细胞或细胞系是cho细胞或细胞系，包括例如cho-s、cho-k1、cho-dg44、cho-duxb11、cho-dukx、chok1sv。在其他实施例中，该细胞或细胞系是cho-k1、mdck或hek293细胞或细胞系。在某些实施例中，该细胞或细胞系是cho-k1细胞或细胞系。

19、在其他实施例中，优化或增强或增加或改进含非天然氨基酸的多肽或蛋白质的产量可以包括，与不存在包含识别一个或多个靶向失活、消融、破坏或敲除的位点或区域的多核苷酸的核酸分子相比，将产量优化或增强或增加或改进至少0.5倍、至少1倍、至少2倍、至少3倍、至少4倍、至少5倍、至少6倍、至少7倍、至少8倍、至少9倍或至少10倍或更多倍。

20、在另一个实施例中，本发明提供了一种通过本文披露的任何方法和细胞制造的疫苗。